science-review.ru
На всех этапах развития онтогенез органов и систем организма, сопровождается существенными функциональными перестройками. В условиях качественно меняющихся факторов внешней среды на этапах эмбрионального, пренатального и постнатального развития, становление и развитие регуляторных механизмов становятся одним из основных компонентов перестройки адаптационных реакций организма. Такие динамично меняющиеся условия наиболее полно раскрывают механизмы и возрастные особенности функционирования эритрона как компонента системы крови [4]. Система крови развивающегося организма находится в неравновесном состоянии, запас ее мощности еще не вполне сформирован, а регулирование не установилось на стабильном уровне. Одной из ключевых характеристик эритроцита как универсального транспортера кислорода является резистентность к действию повреждающих факторов, множество из которых активирую механизмы перекисного окисления белков и липидов. Исследование кислотной резистентности эритроцитов позволяет оценить состояние мембран клеток. Высокая частота анемических состояний, разнообразие их форм и тяжесть течения в раннем детском возрасте, делают необходимым изучение этих вопросов в эксперименте.
Целью исследования стало изучение особенностей резистентности эритроцитов к действию соляной кислоты в раннем постнатальном онтогенезе у крыс при острой гемолитической анемии.
Эксперимент выполнен на 60 половозрелых белых крысах-самках массой 220 грамм и 360 крысятах в возрасте от 1, 5, 15,10, 21 и 30 суток, по 30 животных на каждую временную точку. Все действия проводились с соблюдением норм и правил проведения экспериментов с участием животных. Животные были разделены на контрольную (30 половозрелых животных и 180 крысят в возрасте от 1 до 30 дней) и экспериментальную группы (30 половозрелых животных и 180 крысят в возрасте от 1 до 30 дней). В экспериментальной группе острая гемолитическая анемия моделировалась подкожным введением раствора фенилгидразина (ФГ) в дозе 30 мг/кг массы животного.
У животных контрольных и экспериментальных групп в динамике развития анемии определялась способность эритроцитов противостоять действию 0.004 Н раствора соляной кислоты [1]. В основе кислотного гемолиза лежит агрегация денатурированных мембранных белков при снижении рН до 4.0 [2]. Гемолиз регистрировали при помощи устройства, состоящего из термостатированной кюветы (в ней поддерживалась температура 24оС), ультратермостата, фотоэлектроколориметра и регистрирующего потенциометра. Суспензию эритроцитов и гемолизирующий раствор помещали в кювету в соотношении 1:1 (2 мл суспензии + 2 мл раствора), гемолитик вносили полуавтоматическим шприцем- дозатором. Запись кривой кислотного гемолиза производилась при скорости движения диаграммной ленты 1 см/мин. При расшифровке полученных кривых кинетики разрушения эритроцитов определяли следующие показатели: время начала гемолиза (Т0 ); время 50%-ного гемолиза (Т50 ); время окончания гемолиза (Т100 ); длительность гемолиза (Тг); интегральный показатель эритрограммы (ИП):[6].
ИП = SЭt х ti,
где Эt - доля эритроцитов со стойкостью ti; ti - стойкость (время разрушения) группы эритроцитов (мин).
Полученные первичные данные обрабатывались при помощи комплекса статистических методик [5], включающего в себя: определение среднего, его ошибку, дисперсию. Для определения достоверности различия средних применяли непараметрический критерий Манна – Уитни, за уровень статистической достоверности принимали р<0,05.
В результате эксперимента у взрослых крыс наблюдалось повышение кислотной резистентности эритроцитов на третий день после введения ФГ: Т50 увеличивалось с 5.82±0.2 мин в контроле до 6.65±0.2 мин (p<0.01), ИП - с 6.00±0.19 до 6.8±0.2 (p<0.01). Далее стойкость красных клеток к действию соляной кислоты уменьшалась, но и к окончанию исследования (14-е сутки) оставалась выше, чем у контрольных животных (p<0.05).
В раннем постнатальном онтогенезе были выявлены следующие особенности кислотной резистентности эритроцитов при острой гемолитической анемии (табл. 1).
У 1-дневных крысят отмечалось повышение кислотной стойкости эритроцитов по сравнению со средневозрастными значениями уже на первые сутки после введения ФГ: Т50 составляло 7.08±0.24 мин при 5.47±0.31 мин в контроле (p<0.001), а ИП кислотной стойкости - 7.57±0.28 при 5.62±0.32 в контроле (p<0.001). На вторые сутки все показатели приближаются к уровню контрольных животных, лишь Т50 оставалось выше, чем в контроле (p<0.01).
Таблица 1
Динамика интегрального показателя кислотной резистентности эритроцитов после введения фенилгидразина у крысят разного возраста
|
Показатели |
Группа |
Срок наблюдения (сутки) |
|||||||||
|
1 |
2 |
3 |
5 |
7 |
|||||||
|
1-дневные крысята |
|||||||||||
|
Интегральный показатель |
Контроль |
5.62±0.32 |
6.96±0.39 |
7.91±0.96 |
6.70±0.48 |
5.13±0.46 |
|||||
|
Опыт р |
7.57±0.28 <0.001 |
7.42±0.18 >0.2 |
7.88±0.67 >0.8 |
6.77±0.29 >0.8 |
6.19±0.24 >0.05 |
||||||
|
5-дневные крысята |
|||||||||||
|
Интегральный показатель |
Контроль |
6.92±0.43 |
6.01±0.45 |
5.70±0.36 |
6.96±0.46 |
6.16±0.18 |
|||||
|
Опыт р |
8.31±0.41 <0.05 |
7.57±0.16 <0.005 |
7.59±0.43 <0.005 |
7.46±0.62 >0.5 |
6.81±0.16 <0.02 |
||||||
|
10-дневные крысята |
|||||||||||
|
Интегральный показатель |
Контроль |
5.46±0.34 |
6.91±0.52 |
5.21±0.06 |
5.84±0.33 |
5.77±0.46 |
|||||
|
Опыт р |
6.86±0.14 <0.005 |
7.50±0.45 >0.2 |
5.99±0.27 <0.02 |
6.81±0.33 >0.05 |
7.67±0.49 <0.02 |
||||||
|
15-дневные крысята |
|||||||||||
|
Интегральный показатель |
Контроль |
6.89±0.26 |
5.27±0.36 |
5.32±0.16 |
5.91±0.28 |
5.70±0.19 |
|||||
|
Опыт р |
7.20±0.39 >0.5 |
6.32±0.28 <0.05 |
6.04±0.21 <0.02 |
6.62±0.40 >0.1 |
5.72±0.28 >0.8 |
||||||
|
21-дневные крысята |
|||||||||||
|
Интегральный показатель |
Контроль |
6.05±0.24 |
6.68±0.31 |
5.97±0.29 |
5.52±0.16 |
6.78±0.20 |
|||||
|
Опыт р |
6.34±0.61 >0.5 |
5.36±0.40 <0.05 |
6.78±0.18 <0.05 |
7.07±0.37 <0.005 |
6.08±0.43 >0.1 |
||||||
|
30-дневные крысята |
|||||||||||
|
Интегральный показатель |
Контроль |
5.98±0.40 |
5.71±0.38 |
6.30±1.15 |
4.36±0.94 |
5.55±0.40 |
|||||
|
Опыт р |
7.16±0.21 <0.02 |
6.86±0.13 <0.02 |
7.70±0.64 >0.2 |
7.50±0.46 <0.02 |
6.18±0.44 >0.2 |
||||||
В 5-дневном возрасте кислотная резистентность эритроцитов также повышалась на первые сутки после воздействия: ИП был равен 8.31±0.41 при 6.92±0.43 (p<0.05). Однако в отличии от предыдущей возрастной групп он оставался выше уровня контроля до третьего дня эксперимента (p<0.005) и начинал снижаться только с пятых суток после введения препарата.
Изменение кислотной стойкости эритроцитов 10-дневных крысят при острой гемолитической анемии напоминает таковую у 1-дневных крысят.
Повышение устойчивости эритроцитов к гемолитическому действию кислоты у 15-дневных крысят характеризуется некоторой инертностью; так ИП достоверно повышался только на второй день эксперимента, оставаясь на этом уровне до третьих суток, а затем снижался.
Существенная особенность изменения кислотной стойкости эритроцитов после введения ФГ наблюдалась у 21-дневных крысят. В отличие от других возрастных групп в первые два дня показатели не только не повышались, а напротив снижались. На второй день Т50 укорачивалось до 5.11±0.33 мин при 6.38±0.37 мин в контроле (p<0.05), а ИП был равен 5.36±0.4 при 6.68±0.31 в контроле (p<0.05). Однако в дальнейшем кислотная стойкость повышалась, ИП к пятым суткам увеличивался до 7.07±0.37 при 5.52±0.16 в контроле (p<0.005).
У 30-дневных крысят резистентность мембраны эритроцитов к действию соляной кислоты повышалась на первые сутки после воздействия (p<0.02), при этом своих максимальных значений Т50 и ИП достигали к пятому дню: Т50 составляло 7.17±0.39 мин при 4.15±0.95 мин в контроле (p<0.02), ИП - 7.50±0.46 при 4.36±0.94 в контроле (p<0.02).
Как видно, в более младших возрастных группах (1-, 5-, 10- и 15-дневные крысята) повышение кислотной стойкости красных клеток крови при острой гемолитической анемии происходит раньше, чем у взрослых животных. В более старшем возрасте (21- и 30-дневные крысята) пик кислотного гемолиза приходится на более поздний срок - пятые сутки. В большинстве групп происходит восстановление нормальных значений к окончанию срока наблюдения (седьмой день), у взрослых животных даже к четырнадцатому дню эксперимента кислотная устойчивость эритроцитов остается повышенной.
Вероятно, в результате напряженности эритропоэза в кроветворных органах крысят младших возрастных групп образуется резерв незрелых красных клеток, обладающих повышенной кислотной стойкостью, которые при дополнительном эритропоэзстимулирующем воздействии быстро выходят в циркуляцию, обуславливая более раннюю реакцию со стороны эритрона [3, 8, 11].
Менее стойкое, нежели у взрослых крыс, повышение резистентности эритроцитов к действию соляной кислоты в условиях острой гемолитической анемии может быть следствием напряженного состояния эритропоэза и ограниченности его функциональных резервов в раннем возрасте.
При переходе 21-дневных крысят с молочного на дефинитивный тип питания наблюдается активация кроветворения при еще не сформированных механизмах его регуляции. Именно с этого возраста у данных животных преимущественный синтез эритропоэтина наблюдается в почке [9, 10]. При этом эритроциты, образующиеся в основном в красном костном мозге, по своим свойствам практически не отличаются от эритроцитов взрослых животных. Вероятно, данный эффект вызван интенсификацией эритродиереза, обусловленной необходимостью элиминации эритроцитов, образованных в предшествующие возрастные периоды и не способных адекватно обеспечивать кислородом растущий организм. Это позволяет предположить критическое значение этого возрастного периода в становлении функции эритрона [7]. Наблюдаемое снижение кислотной стойкости у крысят этого возраста подтверждает это предположение.