science-review.ru
В адаптации живых организмов к изменяющимся условиям среды участвует одна из ключевых гомеостатических структур – система крови, которой принадлежит решающая роль в неспецифических и специфических реакциях организма, определении его резистентности и реактивности. Удобными видами-индикаторами считаются амфибии, обладающие хорошо развитой нервной, иммунной, гематологической системами [1, 2] и тонко реагирующие на любые изменения в среде обитания. Известно, что под воздействием стрессорных факторов среды снижается жизнеспособность иммунокомпетентных клеток [3], активизируются процессы воспаления [4], повышается интенсивность окислительных процессов, связанных с генерацией активных форм кислорода и деструкцией белков [5]. При значительном объеме исследований в области экологической физиологии практически отсутствуют работы по морфологическому анализу эритроцитов крови и реакциям окислительного метаболизма видов-индикаторов, обитающих в специфических условиях среды обитания. Между тем, в силу широкой природной распространенности белков и стабильности продуктов их окисления [6], механизмам цитогенетического и окислительного гомеостаза организмов уделяется повышенное внимание в связи с возрастающим прессом антропогенного воздействия на природные экосистемы.
Цель работы: оценка микроядер и интенсивности окислительных реакций в крови озерных (Pelophylax ridibundus) и прудовых лягушек (P. lessonae), обитающих на антропогенно-трансформированных территориях Нижегородской области.
Материалы и методы исследования
Материалом работы служили сборы озерных (Pelophylax ridibundus, Pallas, 1771) (80 особей) и прудовых (Pelophylax lessonae, Camerano, 1882) (40 особей) лягушек, обитающих в шести водоемах Нижегородской области, различающихся абиотическими условиями. Сбор амфибий осуществляли в течение полевого сезона 2017 года на водоемах: оз. Березовское (Нижегородская обл., Богородский р-н), (широта 43.622971731141, долгота 56.146989027575). Озеро часто посещается рыбаками, на расстоянии 500 метров от озера находится автостоянка. Река Кудьма у п. Ветчак (Нижегородская обл., Кстовский р-н), (широта 56.096735, долгота 44.314317). Основные загрязнители поступают в реку от предприятий г. Богородска и нефтеперерабатывающего завода г. Кстово. Оз. Силикатное (г. Н. Новгород, Сормовский р-н), (широта 56.370912, долгота 43.777608). Водоем создан искусственно на месте добычи песка для бетонных изделий ЗКПД-4. Глубина в озере достигает 20 м берег и дно песчаные, вода прозрачная. Заболоченности практически нет. Торфокарьер Ситниковского орнитологического заказника (далее – торфокарьер) (Нижегородская обл., Борский р-н), (широта 56.439791, долгота 44.072462). Представляет собой крупную систему водоемов выработанных торфяных месторождений разного типа. Болото п. Белкино (Нижегородская обл., Борский р-н), (широта 56.286208, долгота 44.548075). Низинное болото, расположено рядом с частными огородами и садами. Оз. Вторчермет (г. Н. Новгород, Московский р-н), (широта 56.311944, долгота 43.848889). Искусственный водоем, созданный на месте добычи грунта. Рядом проходит железная дорога, расположены массивы садов и гаражи, берега и прибрежная часть водоема захламлены бытовым мусором.
В прибрежной зоне водоемов были отобраны пробы воды, в которых с помощью спектрофотометра Hach DR-2800 определены химические загрязнители: железо общее, марганец, медь, хром, нитрат-ионы (NO3), нитрит–ионы (NO2), хлориды, сульфаты, сульфиды, нефтепродукты и водородный показатель (рН). По результатам анализа был произведен расчет удельного комбинаторного индекса загрязненности воды УКИЗВ [7] по формуле
где Sj – комбинаторный индекс загрязненности воды в j-м створе; Nj – число учитываемых в оценке ингредиентов; Sj' – удельный комбинаторный индекс загрязненности воды в j-м створе.
У всех особей была взята кровь для определения количественного содержания эритроцитов (тыс/мм3), лейкоцитов (тыс/мм3) и приготовления мазков для оценки микроядерного теста. Подсчет микроядер [8] осуществляли на микроскопе Meiji Techno с использованием иммерсионного объектива при общем увеличении x1500, просматривая для каждой особи по 2 препарата, анализируя 1000 эритроцитов на препарат (40000 клеток на выборку). Дифференцировали четыре вида микроядер: 1 – оформленные; 2 – прикрепленные; 3 – палочковидные; 4 – разрыхленные. Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФ) с образованием альдегид-(АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) [5]. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрометре СФ-2000 при пяти длинах волн: 230, 270, 370, 430 и 530 нм. Расчет содержания 2,4-ДНФГ в сыворотке крови выражали в единицах оптической плотности на мл/ сыворотки (ОЕ/мл).
Статистический анализ проводили непараметрическими методами в среде R-studio и программе STATISTIСA 10.0 с расчетом критериев: Краскела – Уоллиса (H) (при множественном сравнении независимых групп по одному признаку); Данна (D) (множественный критерий при попарном сравнении групп), коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) (при анализе взаимосвязи) и по критерию z, при сравнении долей микроядер. Критический уровень значимости (р) принимали = 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Все исследованные водоемы Нижегородской области характеризовались повышенным содержанием загрязняющих веществ. Отметим высокое содержание в торфокарьере железа (1,4 мг/л), марганца (3,75 мг/л и сульфидов (22,5 мг/л). Воды р. Кудьмы характеризовались значительным загрязнением медью (9,5 мг/л) и нефтепродуктами (0,21 мг/л). В болоте п. Белкино отмечено высокое содержание железа (0,63 мг/л), марганца (2,4 мг/л), меди (0,17 мг/л) и хрома (0,089 мг/л). По индексу УКИЗВ исследованные водоемы в порядке возрастания расположились в следующем порядке: оз. Вторчермет (7,38, грязная, 4-ый класс, разряд «б») – оз. Силикатное (7,6, грязная, 4-ый класс, разряд «б») – торфокарьер (8,1, очень грязная, 4-ый класс, разряд «в») – оз. Березовское (9,94, очень грязная, 4-ый класс, разряд «г») – болото п. Белкино (12,1 экстремально грязная, 5-ый класс) – р. Кудьма у п. Ветчак (18,47 экстремально грязная, 5-ый класс).
При анализе цитогематологических показателей у зеленых лягушек, обитающих в водоемах с высоким уровнем загрязнения (р. Кудьма и болото п. Белкино), выявлено снижение доли эритроцитов, что свидетельствовало об угнетении процессов кроветворения и возрастании содержания лейкоцитов (рисунок), имеющих, по-видимому, адаптивный характер.
Высоким содержанием микроядер в эритроцитах периферической крови характеризовались озерные лягушки, обитающие в оз. Березовское (11,9 ± 1,47/1000 кл.), и прудовые лягушки оз. Вторчермет (7,17 ± 0,85/1000 кл). Низкое содержание микроядер характерно для популяций лягушек болота п. Белкино (2,7 ± 0,39/1000) и торфокарьера (3,7 ± 0,49/1000). Наиболее часто в эритроцитах периферической крови лягушек всех исследованных популяций встречались разрыхленные (23,6 %) и прикрепленные микроядра (73,6 %), доля оформленных микроядер (2,2 %) выражена слабо, а палочковидные микроядра (0,61 %) обнаруживались не во всех выборках лягушек. С помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмана выявлена сильная взаимосвязь, между количеством оформленных микроядер в крови лягушек и содержанием в водной среде обитания железа (r = 0,88, p = 0,021), марганца (r = 0,92, p = 0,009), нитритов (r = 0,86, p = 0,025). Установленным фактом является возрастание частоты возникновения микроядер и других ядерных аномалий в эритроцитах рыб после пребывания рыб в воде, содержащей тяжелые металлы: ионы хрома (VI), железа, меди и др. [9, 10]. Известно, что нитриты взаимодействуют с гемоглобином крови и окисляют в нем 2-валентное железо. В результате образуется метгемоглобин, который уже не способен переносить кислород. Это нарушает нормальное дыхание клеток и тканей организма (с развитием тканевой гипоксии), вследствие чего накапливаются молочная кислота, холестерин и снижается интенсивность синтеза белковых продуктов, в том числе белков тубулинов, входящих в состав микротрубочек веретена деления и отвечающих за процессы расхождения хромосом, что также приводит к индукции микроядер в эритроцитах.
Интенсификация свободнорадикального окисления белков выявлена в крови лягушек, обитающих во всех исследованных водоемах Нижегородской области (табл. 1).
У озерных лягушек установлена высокая чувствительность к окислению как для альдегидных (при 230 и 270 нм), так и кетонных карбонильных производных (370, 430 и 530 нм) белков сыворотки крови (табл. 2).
Содержание лейкоцитов (тыс/мм3) в крови амфибий, обитающих в специфичных гидрохимических условиях среды, определенных величиной удельного комбинаторного индекса загрязненности воды (УКИЗВ)
Таблица 1
Содержание микроядер в эритроцитах и интенсивность окислительных реакций в крови амфибий, обитающих в водоемах Нижегородской области
|
Показатель |
Водоемы |
|||||||
|
оз. Березовское (1) |
р. Кудьма (2) |
оз. Силикатное (3) |
Торфокарьер (4) |
Болото п. Белкино (5) |
оз. Вторчермет (6) |
|||
|
Сумма микроядер |
476/11,9* |
117/2,92 |
168/4,2 |
148/3,7 |
108/2,7 |
287/7,17 |
||
|
z1-4 = 13,2; р = 0,015; z2-6 = 8,5; р = 0,0022; z1-2 = 14,8; p < 0,001; z1-3 = 12,2; p < 0,001; z1-5 = 15,3; p < 0,001; z2-4 = 1,9; p < 0,001; z3-5 = 3,6; p < 0,001; z3-6 = 5,6; p < 0,001; z4-5 = 2,5; p < 0,001; z4-6 = 6,6; p < 0,001; z5-6 = 9,1 p < 0,001 |
||||||||
|
Суммарная ОМБ, ОЕ/мл |
160,67 ± 1,11 |
184,22 ± 2,03 |
42,65 ± 2,04 |
23,47 ± 2,21 |
60,98 ± 1,39 |
170,62 ± 3,7 |
||
|
D1-3 = 4,09; р = 0,006; D1-4 = 5,82; p < 0,001; D2-3 = 6,75; p < 0,001; D2-4 = 8,47; р < 0,001; D2-5 = 5,1; p < 0,001; D3-6 = 5,44; р < 0,001; D4-5 = 3,38; р = 0,011; D4-6 = 7,17; р < 0,001; D5-6 = 3,75; р = 0,002 |
||||||||
Примечание. *– в числителе: число эритроцитов с микроядрами в выборке, шт.; в знаменателе: доля клеток с микроядрами на 1000 эритроцитов; z – критерий сравнение долей; D – критерий Данна; р – уровень значимости, при множественных сравнениях производилась коррекция показателя с помощью поправки Холма.
Таблица 2
Показатели окислительной модификации белков (ОМБ) сыворотки крови озерных лягушек (Pelophylax ridibundus)
|
Водоемы |
Показатели ОМБ сыворотки крови, ОЕ/мл |
||||
|
230 нм |
270 нм |
370 нм |
430 нм |
530 нм |
|
|
Торфокарьер |
11,99 ± 1,33 |
3,42 ± 0,51 |
3,61 ± 0,89 |
2,96 ± 0,94 |
1,49 ± 0,62 |
|
Оз. Силикатное |
11,14 ± 0,56 |
11,92 ± 0,77 |
6,79 ± 0,33 |
5,87 ± 0,37 |
6,93 ± 1,58 |
|
Оз. Березовское |
39,97 ± 0,75 |
36,01 ± 0,43 |
32,19 ± 0,61 |
29,79 ± 0,4 |
22,71 ± 0,69 |
|
Р. Кудьма |
59,47 ± 0,56 |
41,93 ± 0,94 |
37,70 ± 1,26 |
35,71 ± 0,88 |
9,41 ± 0,35 |
|
Статистические показатели Критерий Крускала – Уоллеса (Н) |
Н = 66,70 р < 0,001 |
Н = 70,81 р < 0,001 |
Н = 68,43 р < 0,001 |
Н = 69,47 р < 0,001 |
Н = 61,69 р < 0,001 |
|
Критерий Данна (D) |
D1-3 = 4,13, p = 0,0002; D1-4 = 6,85, p < 0,001; D2-3 = 4,03, p = 0,0003; D2-4 = 6,76, p < 0,001; D3-4 = 2,72, p = 0,039 |
D 1-3 = 5,65, p < 0,001; D 1-4 = 7,83, p < 0,001; D 2-3 = 3,05, p = 0,014; D 2-4 = 5,23, p < 0,001 |
D 1-3 = 5,34, p < 0,001; D 1-4 = 7,58, p < 0,001; D 2-3 = 3,31 p = 0,006, D 2-4 = 5,53, p < 0,001 |
D 1-3 = 5,15, p < 0,001; D 1-4 = 7,68, p < 0,001; D 2-3 = 3,21, p = 0,008; D 2-4 = 5,74, p < 0,001 |
D 1-2 = 2,84, p = 0,027; D 1-3 = 7,69, p < 0,001; D 1-4 = 4,43, p < 0,001; D 2-3 = 4,84, p < 0,001; D 3-4 = 3,26, p = 0,007 |
Примечание. Статистически значимое значение уровня значимости (р) приведено с учетом поправки Холма.
Таблица 3
Показатели окислительной модификации белков (ОМБ) сыворотки крови прудовых лягушек (Pelophylax lessonae)
|
Водоемы |
Показатели ОМБ сыворотки крови, ОЕ/мл |
||||
|
230 нм |
270 нм |
370 нм |
430 нм |
530 нм |
|
|
Оз. Вторчермет |
51,03 ± 2,44 |
39,04 ± 0,98 |
34,08 ± 1,09 |
29,88 ± 1,04 |
16,59 ± 1,1 |
|
Болото п. Белкино |
15,06 ± 0,40 |
13,97 ± 0,38 |
12,60 ± 0,29 |
11,33 ± 0,70 |
8,02 ± 0,59 |
|
Критерий Манна – Уитни (U) |
U = 5,40 p < 0,001 |
U = 5,40 p < 0,001 |
U = 5,41 p < 0,001 |
U = 5,40 p < 0,001 |
U = 4,46 p < 0,001 |
Примечание. Статистически значимое значение уровня значимости (р) приведено с учетом поправки Холма.
Результаты оценки окислительной модификации белков сыворотки крови прудовых лягушек выявили более интенсивное окисление у особей популяции амфибий, обитающих в оз. Вторчермет (г. Нижний Новгород, Московский район). Отметим, что интенсивность окисления альдегидных и кетонных карбонильных производных белков сыворотки крови у этих лягушек была выше в 2,5–3 раза, по сравнению с аналогичными показателями прудовых лягушек болота п. Белкино (табл. 3).
Установлена сильная положительная корреляционная взаимосвязь суммарной ОМБ с содержанием в водоемах хлоридов (r = 0,84, p = 0,036) и сильная отрицательная взаимосвязь между интенсивностью окисления альдегидных (270 нм: r = –0,91, р = 0,012), кетонных карбонильных производных (370 нм: r = –0,87, р = 0,023; 430 нм: r = –0,87, р = 0,025; 530 нм: r = –0,83, р = 0,043) с содержанием железа. Можно полагать, что комплексное воздействие химических загрязнителей водной среды нарушает формирование сложных механизмов обеспечения гомеостатического равновесия в системе «организм – среда обитания», в том числе цитогенетическую стабильность, и окислительный баланс. Железо является металлом переменной валентности и участвует в катализируемом окислении белков. Механизм действия железа как тяжелого металла заключается в основном в стимуляции образования активных форм кислорода и в ингибировании активных групп ферментов, в том числе и антиоксидантных. Медь по своей химической природе сильнее связывается с органическими соединениями по сравнению с другими металлами. Ионы меди способны вытеснять функциональные металлы из ферментов и восстанавливать молекулярный кислород до активных форм кислорода. Эти свойства делают медь сильным токсикантом.
Полученные результаты свидетельствуют о существенных нарушениях цитогенетического и окислительного гомеостаза, происходящих в организме амфибий, подверженных воздействию урбанизации и загрязнению, указывают на экологическое неблагополучие среды обитания и расширяют теоретические представления о закономерностях изменения адаптивных реакций организма в условиях антропогенной нагрузки.