science-review.ru
Глюкоза является главным моносахаридом крови и тканей организма человека и животных. При её катаболизме в аэробных и анаэробных условиях происходит образование энергии в форме АТФ (аденозинтрифосфат), которая используется для обеспечения функциональной активности клеток. Помимо гликолиза, ещё одним направлением распада глюкозы считается гексозомонофосфатный (пентозный, пентозофосфатный, апотомический) путь, связанный с обеспечением клеток пентозами и НАДФН2 (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) для анаболических целей.
Кроме интенсивности распада, уровень глюкозы в клетках и внеклеточной жидкости зависит от:
1) поступления глюкозы в организм с продуктами питания (в основном в виде гомополисахарида растительных тканей – крахмала и его аналога в клетках животных – гликогена);
2) образования глюкозы из углеводного резерва – гликогена ткани печени и скелетных поперечно-полосатых миоцитов;
3) биосинтеза из веществ неуглеводной природы (лактата, пирувата, гликогенных аминокислот, метаболитов цикла трикарбоновых кислот) в результате реакций глюконеогенеза [1].
Направление превращения глюкозы зависит от соотношения окисленной и восстановленной форм НАД (никотинамидадениндинуклеотид). Представляется, что окисленная форма НАД является аллостерическим активатором регуляторных, скорость-лимитирующих ферментов гликолиза (гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы). Восстановленная форма НАД, наоборот, ингибирует гликолиз.
При биотрансформации этилового спирта в результате функционирования фермента алкогольдегидрогеназы происходит избыточное накопление восстановленной формы НАД в клетках. Данный феномен носит название «протонная интоксикация», вследствие того что возникают многочисленные изменения метаболических процессов [2]. Данный момент также оказывает влияние на содержание глюкозы в клетках и тканях организма. В связи с этим актуальным видится вопрос о возможной коррекции изменений метаболизма глюкозы в условиях алкоголизации.
Цель исследования: выяснить влияние L-карнитина на гликемический статус крыс, подвергшихся принудительной алкоголизации.
Задачи исследования:
1) оценить уровень глюкозы в сыворотке крови алкоголизированных крыс;
2) определить сывороточную концентрацию глюкозы у крыс при реакции отмены этанола в условиях введения L-карнитина.
Материалы и методы исследования
В эксперименте использовали 39 белых беспородных крыс-самцов массой 220 г, у которых вызывали реакцию отмены этанола. Для этого животным внутрижелудочно вводили 25 % раствор этанола в дозе 8 г/кг массы тела, что соответствует половине полулетальной дозы. Этанол вводили в течение 4,5 суток утром и вечером, интервал между введениями составлял 12 часов. После завершения алкоголизации животных выводили из эксперимента путём декапитации под эфирным наркозом. Животные были разделены на группы: группа «А» (n = 10) – животные, которым вводили этанол по схеме, указанной выше; группа «L-KAР» (n = 10) – животные, которым интрагастрально вводили L-карнитин (препарат «L-КАР») в течение 4,5 суток в дозе 300 мг/сут.; группа «A+L-KAР» (n = 10) – алкоголизированные крысы, которым при формировании реакции отмены этанола интрагастрально вводили L-карнитин в дозе 300 мг/сут. (препарат «L-КАР»); группу «К» (n = 9) составили животные, которым вводили физиологический раствор хлорида натрия в эквиобъёмном количестве.
Содержание глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с использованием набора реактивов компании «Вектор-Бест». Указанный метод определения концентрации глюкозы в сыворотке крови заключается в том, что глюкоза под влиянием фермента глюкозооксидазы подвергается окислению. В качестве продуктов реакции образуются глюконовая кислота и пероксид водорода. Последний подвергается разрушению при участии фермента пероксидазы, что сопряжено с конденсацией парааминоантипирина и фенола с формированием окрашенного соединения (иминофеназон). Интенсивность окраски реакционной смеси прямо пропорциональна концентрации глюкозы в исследуемой пробе.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием компьютерных программ Microsoft Excel, Statistica 6.0. В качестве параметров описательной статистики использовали медиану, верхний и нижний квантили.
Для оценки статистической значимости различий применяли непараметрические критерии: Манна-Уитни (U) для независимых выборок и Вилкокcона (W) для связанных выборок. Уровень значимости был общепринятым для биологических исследований (p < 0,05) [3].
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ сыворотки крови животных, подвергнутых принудительной алкоголизации, свидетельствует о том, что в группе «L-КАР» уровень глюкозы снижен на 23,9 % (pU = 0,002) по сравнению с группой контроля. В группе «А+L-KAР» содержание глюкозы в сыворотке крови увеличено на 13,6 % (pW = 0,017) по отношение к группе «L-KAР».
Регуляция уровня глюкозы в различных средах организма человека сопряжена с определенным значением соотношения АДФ/АТФ (аденозиндифосфат/аденозинтрифосфат). Накопление АДФ стимулирует распад глюкозы и отрицательно влияет на ее биосинтез. АТФ – аллостерический ингибитор гликолиза и активирует образование глюкозы.
Дополнительно к этому продукт алкогольдегидрогеназной реакции – ацетальдегид – блокирует действие компонентов митохондриальной дыхательной цепи, тем самым уменьшая образование АТФ.
Также хорошо известно, что при алкогольной интоксикации ингибируется действие регуляторного фермента глюконеогенеза – фосфоенолпируваткарбоксикиназы. Это является ключевым моментом в изменениях обмена глюкозы при воздействии этилового алкоголя в связи с тем, что накопление НАДН2 и уменьшение уровня АТФ оказывают разнонаправленное влияние на распад и синтез глюкозы и, по-видимому, нивелируют эффекты друг друга.
Однако в целом совокупность указанных изменений метаболизма глюкозы определяет возникновение гипоэнергетического состояния клеток. Поэтому в аспекте корригирующих мероприятий по устранению нарушений метаболизма при алкогольной интоксикации и алкогольной зависимости важнейшее значение приобретает восстановление энергетического потенциала клеток, восстановление уровня АТФ.
Современные представления о механизмах продукции АТФ за счёт различных метаболитов свидетельствуют о том, что последовательность использования клетками (митохондриями) субстратов для образования энергии определяется кинетическим параметром – скорость реакции. Согласно данным профессора В.Н. Титова [4], очередность использования веществ в митохондриях для синтеза АТФ может быть следующей: а) производные наиболее короткой по числу атомов углерода жирной кислоты (масляной) – кетоновые тела: ацетон, ацетоуксусная кислота, бета-оксимасляная кислота; б) короткоцепочечные жирные кислоты с длиной углеводородной цепи от 6 до 10 атомов углерода; в) длинноцепочечные высшие жирные кислоты, в наибольшей степени пальмитиновая кислота, в связи с наличием только для неё специфического переносчика; г) глюкоза. Указанная информация предполагает, что глюкоза будет использована митохондриями клеток для окисления в последнюю очередь.
В условиях отмены этанола, прекращения его действия, снижения ингибирующего влияния ацетальдегида на компоненты электрон-транспортной цепи митохондрий необходимость использования всех энергетических субстратов с максимальной эффективностью приобретает особую значимость. В связи с этим интерес представляет действие L-карнитина (препарат L-КАР) в качестве лекарственного вещества, являющегося искусственным аналогом естественного карнитина.
С биохимической точки зрения карнитин представляет собой продукт превращения в клетках насыщенной (предельной) масляной кислоты, содержащей в своем составе четыре атома углерода. В структуре карнитина присутствуют также гидроксильная группа и метильные функциональные группировки (гидрокситриметиламиномасляная кислота).
В связи с выполняемой функцией интрацеллюлярная концентрация карнитина очень высока и превышает в пятьдесят раз концентрацию данного метаболита в плазме крови. Система активного транспорта обеспечивает содержание карнитина внутриклеточно. Установлены транспортеры с высокой специфичностью для разных типов клеток: кардиомиоцитов, поперечно-полосатых миоцитов, гепатоцитов.
Наличие эссенциальных (незаменимых) аминокислот считается обязательным условием для биосинтеза карнитина. Для обеспечения процесса требуются серосодержащая аминокислота – метионин и диаминомонокарбоновая кислота – лизин.
В соответствии с указанными фактами поступление данных аминокислот с пищевыми продуктами и выполнение биологической реакции экзотрофии (внешнего питания) [5] во многом определяет скорость образования карнитина и эффективность реализации его функции.
Основной локализацией синтеза карнитина в организме являются скелетные, поперечно-полосатые миоциты. Считается, что в клетки иной локализации карнитин транспортируется из пула межклеточной жидкости.
Принято считать, что переход неэтерифицированных высших жирных кислот, а также их неполярной, активированной формы – ацил-КоА – через мембрану митохондрий без карнитина невозможен. Естественная, физиологическая функция карнитина связана с тем, что он обеспечивает транспорт насыщенной (предельной) пальмитиновой высшей жирной кислоты в пространство митохондриального матрикса. Каталитическая активность фермента – карнитинпальмитоилацилтрансферазы – сопряжена с выполняемой функцией.
Процесс транспорта жирной кислоты внутрь митохондрий представляется следующим образом: а) во-первых, происходит процесс переэтерификации высшей жирной кислоты из связи с коферментом А в ее связь с карнитином; б) карнитин-ацилкарнитинтранслоказа осуществляет транспорт карнитиновых эфиров через внутреннюю мембрану митохондрий. Одновременно происходит удаление из матриксного пространства митохондрий свободного карнитина; в) обратная переэтерификация жирной кислоты в эфир с коферментом А осуществляется после прохождения жирной кислотой внутренней мембраны и ее появления в матриксе митохондрий. Это обеспечивается действием карнитинпальмитоилтрансферазы. Результатом всего процесса становится появление жирной кислоты в активированной, неполярной форме тиоэфира в матриксе митохондрий.
Как видно из характеристики процесса, именно эта форма жирной кислоты необходима для начала транспорта жирных кислот из цитозоля в митохондрии; для дальнейшей транспортировки жирных кислот через внутреннюю мембрану митохондрий; для последующего окисления высших жирных кислот с образованием конечных продуктов обмена веществ и энергии в форме АТФ.
Жизнедеятельность клеток организма определяет необходимость формирования в митохондриях при β-окислении высших жирных кислот в аэробных условиях центрального метаболита обмена веществ – ацетил-КоА. Дальнейшие биохимические события, связанные с его превращением внутримитохондриально, представляются его распадом в цикле трикарбоновых кислот (Кребса) до двух молекул конечного продукта обмена веществ – углекислого газа. В ходе данного метаболического пути в результате четырех реакций, сопряженных с функционированием компонентов дыхательной цепи, происходит формирование молекул восстановленной формы коферментов НАД, ФАД (флавинадениндинуклеотид). Они обеспечивают инициацию работы дыхательной цепи митохондрий по образованию АТФ [4].
При алкоголизме, в условиях гипоэнергетического состояния эффективность функционирования цикла Кребса снижается, что предполагает изменение направления использования ацетил-КоА в сторону конденсации молекул между собой. В результате взаимодействия двух молекул ацетил-КоА формируется ацетоацетил-КоА. Превращения с участием ацетил-КоА приводят к образованию малонил-КоА.
Биосинтез малонил-КоА в матриксе подавляет активность карнитинпальмитоилацилтрансферазы, что уменьшает поступление активированных, неполярных форм жирных кислот – ацил-КоА в митохондрии. Соответственно, снижается интенсивность β-окисления высших жирных кислот и еще больше усугубляется выраженность гипоэнергетического состояния клеток.
Снижение уровня глюкозы в группе «L-KAР» может быть обусловлено активацией окисления высших жирных кислот, что определяет, в соответствии с константой скорости реакции, усиление распада глюкозы внутриклеточно. Запуск действия осмотических законов предполагает переход глюкозы из крови в клетки и объясняет выявленные изменения её уровня. С другой стороны, возможное увеличение интенсивности окисления высших жирных кислот в митохондриях, обусловленное действием L-карнитина по транспорту пальмитата, предполагает к мнению об увеличении уровня АТФ в митохондриях, выходе из гипоэнергетического состояния и вследствие этого восстановлении активности процесса глюконеогенеза.
Статистический анализ полученных данных говорит о том, что уровень глюкозы крови алкоголизированных животных не отличается от значений в группе интактных животных. Имеется лишь тенденция к снижению показателя. Литературные данные показывают, что при длительном хроническом воздействии алкоголя на клетки организма уровень глюкозы крови снижается, развивается состояние гипогликемии, обусловленное нарушением глюконеогенеза в печени.
Однако при отмене этанола на первый план выходят регуляторные эффекты гормонов мозгового слоя надпочечников (группа катехоламинов: дофамин, норадреналин, адреналин). Можно предположить, что отсутствие изменения содержания глюкозы в группе «А» связано с их влиянием на углеводный обмен.
Это обстоятельство связано с тем, что метаболическими эффектами катехоламинов в плане регуляции обмена углеводов являются:
а) стимуляция фосфоролитического пути распада резервного гомополисахарида организма животных – гликогена – в скелетных, поперечно-полосатых миоцитах и клетках печени. Гликогенолитическое действие катехоламинов реализуется через аденилатциклазный каскадный механизм активации фосфорилазы гликогена;
б) активация процесса синтеза глюкозы из неуглеводных предшественников (глюконеогенеза) в гепатоцитах;
в) подавление активности фосфофруктокиназы и активация фруктозодифосфатазы, что способствует синтезу глюкозы из галактозы и фруктозы.
Статистическая обработка результатов исследования не выявила значимых отличий уровня глюкозы в группе «A+L-KAР» по сравнению с данными группы «A» (pW = 0,678). Данное обстоятельство указывает на отсутствие эффекта L-карнитина в отношении содержания глюкозы в крови алкоголизированных крыс (группа «A»). В то же время выявленное увеличение глюкозы в группе «A+L-KAР» по сравнению с группой «L-KAР» свидетельствует о влиянии этанола на обмен глюкозы. Указанные изменения, вероятно, могут быть объяснены нарушением функционирования дофаминэргической системы организма при алкоголизме.
Заключение
В соответствии с задачами исследования можно сделать заключение:
1) об отсутствии изменений уровня глюкозы в сыворотке крови алкоголизированных крыс в первые сутки развития реакции отмены этанола по сравнению с группой контрольных (интактных) животных;
2) об увеличении содержания глюкозы в сыворотке крови крыс при реакции отмены этанола в условиях введения L-карнитина по сравнению с группой животных, которым вводился только L-карнитин. При сравнении с группой животных, получавших только алкоголь, и контрольной группой статистически значимых изменений не выявлено, что может позволить сделать предположение об отсутствии влияния L-карнитина на основной показатель обмена углеводов – глюкозу – при экспериментальном моделировании физической зависимости от алкоголя.
Материал подготовлен в рамках реализации проекта «Базовые школы РАН».