Scientific journal

Scientific Review. Biological science

ISSN 2500-3399

ПИ №ФС77-57454

Под воздействием экстремальных условий у различных представителей рода Dunaliellа абсолютное содержание всех пигментов в клетках при увеличении концентрации осмотически действующих солей, недостатке биогенных элементов, повышении и понижении температуры, как правило, увеличивается [1–3]. В экстремальных условиях существования в клетках всех видов Dunaliella наблюдается тенденция уменьшения абсолютного содержания хлорофиллов а и в и их суммы.

Стражалка К. и др. (2003) экспериментально доказали, что количество и соотношение пигментов в биомассе изменяется в процессе роста культуры. При этом в период интенсивного роста микроводорослей синтезируется максимальное количество всех пигментов [4]. По данным Alizadeh G.I. et аl. (2019) и Ejaz A. et аl. (2017), абсолютное содержание каротинов в клетках Dunaliella salina уменьшается во время логарифмической фазы роста культуры [5; 6]. В своих исследованиях Масюк Н.П. (1973) накопление каротинов обнаружил лишь при переходе культуры в стационарную фазу [1]. Поэтому мы эксперименты проводили в течение 24 часов в интенсивно накопительном режиме культивирования, где только достигается стационарная фаза роста.

Группой исследователей было показано, что растения обычно обладают высоким уровнем антиокислительной активности и, как правило, содержат большое количество антиоксидантов различной химической природы [7–9], нам хотелось также исследовать в какой степени ионол (классический синтетический антиоксидант) минеральной среды выращивания может влиять на биосинтез каротиноидов и хлорофиллов в клетках Dunaliella salinа в условиях хронических доз УФ-В облучения [10–12].

Цель исследования: изучение влияния различных хронических доз УФ-В на рост и биосинтез пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294, а также модифицированных ионолом в интенсивно накопительном режиме культивирования.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служила галофильная зеленая микроводоросль Dunaliella salina IPPAS D-294, выделенная из соленого озера Масазыр, находящегося на северо-западе территории города Баку.

В условиях хронических доз УФ-В излучения водоросли выращивали при 27 °С в фотореакторах (250 мл), из обычного (контрольные суспензии) и кварцевого (опытные суспензии) стекла, на установке типа УВКВ (установка для выращивания культур одноклеточных водорослей). Источником УФ-В излучения служила ртутная лампа СВД-120. Хроническое УФ-В облучение клеток проводили круглосуточно, с помощью часового механизма. Минеральная среда содержала (г/л): NaCI – 87,5 (1,5 М); KNO3 – 5,0; KH2PO4 – 1,25; MgSO4 – 50; FeSO4 – 0,009 раствор микроэлементов (мг/л) – Ca(NO3)2•H2O – 735; H3BO3 – 735; ZnSO4•7H2O – 615; (NH4)MoO4 – 100; MnCl2•4H2O – 180. Суспензию клеток в фотореакторах в течение 24 часов освещали белым светом (16 Вт/м2) и непрерывно продували смесью (воздух + 1,0 % СО2) с температурой 25 °С. Клетки выращивали в течение 24 часов в интенсивно накопительном режиме культивирования и освещали круглосуточно. Рост культуры определяли периодическим подсчетом числа клеток в камере Горяева под микроскопом или нефелометрически, измерением оптической плотности суспензии на фотоэлектроколориметре.

Для определения пигментов брали 10 мл (с точно определенной оптической плотностью) суспензии, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 4–5 минут. Осадок ресуспендировали в 5 мл 100 % ацетона, вытяжка была прозрачной, а на дне пробирки выпадал белый осадок. Определение концентрации хлорофиллов а и b и суммы каротиноидов в общей смеси пигментов проводили на спектрофотометре.

Содержание пигментов в клеточных экстрактах (100 % ацетон) измеряли на спектрофотометре и рассчитывали на основании коэффициентов Ветштейна [12].

В работе был использован синтетический антиоксидант 2,6 ди-трет-бутил крезол (ионол) в концентрациях 25 и 50 мкМ.

Ионол (M.в. 220,35 г/моль) в чистом виде порошок белого цвета, хорошо растворим в этиловом спирте. В суспензию клеток добавляли синтетический антиоксидант с фиксированной концентрацией (25 мкМ; 50 мкМ) и выращивали в течение 24 часов.

Результаты исследования и их обсуждение

На рис. 1 представлены результаты динамики роста популяции клеток Dunaliella salina IPPAS D-294, выращенных в интенсивной культуре при различных хронических дозах (8,9*103 – 18*103 Эрг/мм2) УФ-В облучения. Как видно из рисунка, хронические дозы 8,9*103 Эрг/мм2 УФ-В излучения подавляют рост культуры до 78 % от контрольных суспензий. Увеличение хронической дозы УФ-В излучения до 11,8*103 Эрг/мм2 снижает показатели роста и конечной биопродуктивности до 71 %. Хронические дозы УФ-В излучения 18*103 Эрг/мм2 приводят к резкому снижению 46 % роста культуры водорослей. На основании полученных результатов установлено, что различные хронические дозы УФ-В излучения при интенсивно накопительном режиме культивирования в течение 24 часов значительно подавляют биопродуктивность водорослей в исследованных условиях.

Интересно было установить количественные показатели биосинтеза пигментов клетками Dunaliella в этих условиях выращивания. На рис. 2 представлены показатели биосинтеза пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294, выращенных при различных хронических дозах УФ-В облучения.

Как видно из рис. 2, УФ-В излучение влияет на биосинтез пигментов в клетках, так, при хронических дозах 8,9*103 и 11,8*103 Эрг/мм2 наблюдается повышение содержания хлорофилла а на 26 % и 16 % соответственно, и подавляется до уровня 66 % при дозе 18*103 Эрг/мм2. В этих условиях в основном подавляется хлорофилл в, биосинтез суммы каротиноидов при этом увеличивается на 23 % и 10 % соответственно. Показатели биосинтеза суммы каротиноидов согласуются с нашими ранее полученными данными [2]. Параметр, характеризующий энергизацию фотосинтетических мембран [13] Хла + Хлв / Кар при увеличении дозы хронического УФ-В излучения уменьшается. Уменьшение этого параметра свидетельствует о подавлении фотосинтетической активности водорослей при действии хронического УФ-В излучения. Защита популяции клеток Dunaliella от хронических доз УФ-В излучения различными синтетическими антиоксидантами и их участие в резистентности популяции является актуальной. Для выявления пригодности синтетического антиоксиданта ионола для защиты популяции клеток от хронических доз УФ-В излучения были проведены следующие предварительные экспериментальные работы. Исследованы различные спиртовые растворы ионола, которые не влияли на темп роста и биопродуктивность культуры в интенсивно накопительном режиме. Экспериментально установлено, что концентрации ионола 25 и 50 мкМ существенно не влияют на ростовые процессы популяции. В присутствии каждой 25 мкМ и 50 мкМ в отдельности концентрации синтетического антиоксиданта в минеральной среде проведены исследования по выращиванию водорослей в течение 24 часов при хронической дозе 8,9*103 Эрг/мм2 (рис. 3).

Как видно из рис. 3, динамика роста культуры при хронической дозе УФ-В излучения (8,9*103 Эрг/мм2) подавляется до 78 % (К). В присутствии ионола (25 мкМ) рост популяции через 24 часа устанавливается на уровне 97 % (19 %-ное увеличение биопродуктивности). Увеличение концентрации синтетического антиоксиданта (50 мкМ) сохраняет биопродуктивность на уровне 87 % (9 %-ное увеличение биопродуктивности). Таким образом, исследованный синтетический антиокидант ионол (2,6 ди-трет-бутил крезол) является эффективным и перспективным препаратом для защиты популяции клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 от хронических доз УФ-В излучения. Интересным было выявление количественных показателей биосинтеза пигментов клетками в присутствии синтетических антиоксидантов в минеральной среде.

На рис. 4 представлены результаты показателей биосинтеза пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294, выращенных при различных хронических дозах УФ-В облучения в присутствии 25 мкМ ионола. Как видно из рисунка, в присутствии синтетического антиоксиданта хлорофилл а в клетках остается на высоком уровне по отношению к клеткам, выращенным в отсутствие ионола (рис. 2). Хлорофилл в в этих условиях увеличивается с повышеним хронической дозы УФ-В излучения. Без синтетического антиоксиданта в клетках подавляется синтез хлорофилла в (рис. 2). Сумма каротиноидов также увеличиваются во всех экспериментах с хроническими дозами УФ-В излучения и в присутствии ионола. Параметр, характеризующий энер- гизацию фотосинтетических мембран Хла + Хлв / Кар, подавляется при увеличении хронической дозы УФ-В излучения в присутствии ионола.

Данные содержания пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294, выращенных при различных хронических дозах УФ-В облучения в присутствии 50 мкМ ионола, представлены на рис. 5. Как видно из рисунка, увеличение концентрации синтетического антиоксиданта заметно проявляет защитную функцию популяции клеток от хронического действия УФ-В излучения при дозах 8,9*103 – 11,8*103 Эрг/мм2 УФ-В излучения, при высокой (18*103 Эрг/мм2) хронической дозе УФ-В излучения биосинтез пигментов подавляется.

Таким образом, синтетический антиоксидант ионол, в концентрациях 25 и 50 мкМ, проявляет защитную функцию (восстанавливает жизнеспособность и биопродуктивность водорослей), стимулирует биосинтез пигментов при выращивании клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 в условиях хронических доз УФ-В излучения. Несмотря на восстановление биопродуктивности в присутствии ионола, функциональная активность клеток, по показателям Хла + Хлв / Кар, подавляется по отношению к контрольным клеткам.