Scientific journal

Scientific Review. Biological science

ISSN 2500-3399

ПИ №ФС77-57454

Проблема регенерации длинных трубчатых костей и взаимодействие их с прилежащими мышцами является весьма актуальной в биологии и медицине. Это обусловлено, с одной стороны, частым травматизмом конечностей и необходимостью коррекции врожденных укорочений, с другой, знание морфологических особенностей окружающих кость тканей при различных воздействиях может позволить существенно сократить время лечения больных. Работы, раскрывающие общность биологических процессов при дистракционном остеосинтезе и в постнатальном развитии, посвящены периферическим нервам [1], фасциям скелетных мышц [2]. Выявлены особенности гемодинамики мышц-антагонистов при лечении оскольчатых переломов голени [3]. Определены гистологические параллели процессов естественного роста большеберцовой мышцы в раннем онтогенезе и индуцированных дозированным растяжением процессов при дистракции, показано преимущество высокодробной круглосуточной автодистракции [4]. Морфофункциональные характеристики икроножной мышцы, являющейся синергистом передней большеберцовой и также подвергающейся дистракционной нагрузке, в доступной литературе не обнаружены, что послужило целью данного исследования.

Цель работы – выявить гистологические, стромально-паренхиматозные и стереоультраструктурные особенности икроножной мышцы собак в периоде раннего постнатального онтогенеза.

Материалы и методы исследования

Исследована икроножная мышца 10 щенков в периоде постнатального развития: новорожденные, 7-, 14-, 21-, 28-суточные, n = 2 для каждого возрастного периода. Фрагменты икроножной мышцы погружали в жидкий азот, изготавливали поперечные криостатные срезы (микротом-криостат МК-25ТУ64-1-856-78, Россия), проводили гистохимическую реакцию по выявлению активности миозиновой АТФ-азы (рН 9,0) по Padycula, Herman в модификации З. Лойда. Часть мышц фиксировали в смеси равных объёмов 2 % глутарового и параформальдегида, полимеризовали в эпоксидных смолах, изготавливали полутонкие срезы (ультратом «Nova», Швеция), окрашивали по M. Ontell. Изучали с помощью стереомикроскопа «AxioScope.A1» и встроенной цифровой фотокамеры «AxioCam» (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). Морфологические особенности стереоультраструктурной организации мышцы щенков исследовали посредством сканирующего электронного микроскопа «JSM-840» (JEOL, Япония). Криостатные срезы использовались для стереометрии [5], изображения получали посредством проекционного микроскопа «Visopan» (Reichert-Jung, Австрия). Определяли: объемную плотность (мм3/мм3) мышечных волокон (VVmf), микрососудов (VVmv), эндомизия (VVend); численную плотность (мм-2) миосимпластов и микрососудов (NAmf; NAmv). Рассчитывали параметр, оценивающий васкуляризацию мышцы и, косвенно, ее оксигенацию, NAmv/NAmf – индекс васкуляризации и видовая константа. Достоверность различий оценивали на основании непараметрического критерия Вилкоксона для независимых выборок, различия считали значимыми при Р < 0,05, обработку цифрового материала осуществляли в программе AtteStat версия 10.8.8, встроенной в Microsoft Excel [6].

Результаты исследования и их обсуждение

Для новорожденных щенков характерен несовершенный миофибриллярный аппарат, наблюдались очень мелкие мышечные волокна и огромное количество соединительнотканных прослоек с немногочисленными микрососудами (рис. 1 а), большое число мышечных волокон гофрированной, спиральной формы, волокна в состоянии контрактур различной степени, минимальное число микрососудов, крупные артерии и вены в широких прослойках перимизия (рис. 2, а). На 7 сутки роста наблюдались микрососуды в эндомизии, которые зачастую ориентировались продольно на поперечных срезах (рис. 1, б), были характерны парные миобласты и группы ядер (миотубы), примыкающие к предсуществующим волокнам либо формирующим самостоятельно новые миоциты (рис. 2, б). В последующие сроки онтогенеза отмечалось постепенное увеличение диаметров мышечных волокон и уменьшение прослоек эндо- и перимизия (рис. 1, в). К 14 суткам роста характерны волокна нормального строения, с поперечной исчерченностью, встречались контрактурно измененные волокна, доля соединительнотканных прослоек существенно уменьшалась по сравнению с новорожденными (рис. 2, в). К 28 суткам идентифицировались 3 метаболических типа мышечных волокон (рис. 1, г), визуализировались картины, описанные выше в различных сочетаниях, в частности пары миобластов вблизи мышечных волокон (рис. 2, г).

По данным стереометрии объемная плотность мышечных волокон была минимальна у новорожденных животных, через 7, 14 и 21 сутки постнатального развития параметр плавно увеличивался, к 28 суткам несущественно снижался (таблица). Численная плотность миоцитов была максимальна у новорожденных щенков, к 7 суткам параметр снижался, составив 85 % от значения на предыдущий срок, к 14 суткам еще более уменьшался, но к 21 суткам развития вновь возрастал, составив 165 % (Р < 0,05) от значения на предыдущий срок и к 28 суткам вновь снижался, составив 66 % от значения параметра в предыдущий срок (Р < 0,05). Подобная ступенчатая динамика параметра была отмечена и для передней большеберцовой мышцы щенков [4].

Объемная и численная плотности микрососудов в раннем постнатальном периоде носили волнообразный характер: к 7 суткам роста значения данных параметров составили 171 и 146 % от значений новорожденных животных соответственно; к 14 суткам параметры снижались, составив 55 и 52 % от значений на предыдущий срок исследования (Р < 0,05); к 21 суткам также снижались значения параметров, составив 47 и 85 % соответственно от значений на 14 сутки (Р < 0,05), и на 28 сутки вновь возрастали, составив 126 и 146 % (Р < 0,05) соответственно от значений на 21 сутки роста. Индекс васкуляризации изменялся подобно численной плотности микрососудов.

Методом сканирующей электронной микроскопии были выявлены особенности цитоархитектоники мышечных волокон и окружающей рыхлой волокнистой соединительной ткани икроножной мышцы. У новорожденных щенков наблюдались узкие мышечные волокна без видимой поперечной исчерченности (рис. 3, а), соединительнотканный компонент во всех сроках наблюдения был представлен тонкими эластическими волоконцами, образующими сети; неветвящимися тяжами коллагеновых волокон, фибробластами, фиброцитами, макрофагамии (рис. 3, б). К 7-м суткам мышечные волокна становились заметно шире, идентифицировалась поперечная исчерченность (рис. 3, в), отмечены веретеновидные фибробласты, различные соединительнотканные волокна (рис. 3, г). К 14-м суткам миоциты характеризовались четкой поперечной исчерченностью (рис. 3, д, е), на 21–28 сутки миоциты были оплетены микрососудами, в том числе в направлении, перпендикулярном ходу мышечных волокон, соединительнотканные прослойки были минимальны (рис. 3, ж, з).

В результате проведенного морфологического исследования выявлены особенности цитоархитектоники, микроциркуляторного русла и стромально-паренхиматозных отношений икроножной мышцы в периоде раннего постнатального развития. Установлено, что динамика большинства стереометрических параметров икроножной мышцы аналогична таковой для передней большеберцовой мышцы щенков [4]. В частности, имеет место волнообразный характер динамики показателей микрососудистого русла: максимальные цифры объемной и численной плотности микрососудов отмечены на 7 сутки постнатального развития, к 21 суткам показатели снижаются и вновь возрастают к 28 суткам. Для числа мышечных волокон выявлена также волнообразная динамика с максимальным увеличением параметра к третьей неделе роста.

Известно, что число мышечных волокон не фиксируется при рождении, а увеличивается в постнатальном периоде, как путем саркомерогенеза предсуществующих волокон, так и путем генеза новых миофибрилл, в основном между рождением и 3-недельным возрастом [7]. Показано, что в возрасте 21 суток очень мелкие волокна, экспрессирующие изоформу тяжелой цепи миозина (MyHC) эмбриона, были заметны по всей мышце. Это не противоречит данным, полученным в настоящем исследовании, где на 21 сутки онтогенеза численность мышечных волокон достоверно возрастает, приближаясь к значению параметра при рождении, при этом у новорожденных параметр обусловлен очень мелкими диаметрами волокон на фоне большого количества соединительнотканного компонента. К 3-недельному возрасту возрастает число волокон при существенном уменьшении доли соединительной ткани. К 28-м суткам роста имеет место увеличение диаметров миоцитов и, соответственно, уменьшение их числа в поле зрения. Известно о функции циклазо-ассоциированных белков (CAP) в регуляции обмена α-актина во время дифференцировки миофибрилл [8]. Переключение α-актина задерживалось у мышей с системной мутацией в CAP2, и миофибриллы оставались недифференцированными у постнатальных мышей. Задержка переключения α-актина совпадает с началом дефицита двигательной функции и гистопатологических изменений, включая высокую частоту встречаемости спиральных волокон типа IIB. То есть тонких нарушений постнатального ремоделирования F-актина достаточно для предрасположенности мышечных волокон к образованию спиральных волокон, которые также имеют место в представленной работе.

В процессе формирования структурно-функциональных единиц микрососудистого русла меняется количество, плотность расположения сосудов, их диаметр, ориентация в пространстве. Наиболее интенсивный рост у белой крысы наблюдался через 7 дней, число капилляров 1302 мм-2, у взрослых животных – 478 мм-2 [9]. В данном исследовании микрососудистое русло в мышце щенков максимально развивается также к 7 суткам, что подтверждено объемной и численной плотностью микрососудов.

В развитии скелетных мышц важную роль играют гормоны щитовидной железы, в частности трийодтиронин, который усиливается дейодиназой 2 типа (Dio2), глобальная инактивация гена Dio2 на ранних этапах онтогенеза нарушает дифференцировку и регенерацию скелетных мышц в ответ на мышечное повреждение [10]. Исследовали рост мышц и типы волокон в мышцах задних конечностей в постнатальном развитии у свиней: быстросокращающиеся волокна с низким окислительным метаболизмом (IIB) имели наибольшую площадь поперечного сечения [11]. В исследованиях митохондрий мышц выявлено, что их сеть изменяется с продольной ориентации на перпендикулярную по отношению к миосимпластам в течение 2–3 недель после рождения в гликолитических скелетных мышцах [12]. Эти структурные изменения сопровождаются изменением профиля экспрессии белков от митохондрий, предназначенных для сборки миосимпластов, в митохондрии, узкоспециализированные для клеточного энергетического метаболизма, определяя типы мышечных волокон. Выявлен микропептид, локализующийся в митохондриях, который усиливает их дыхательную активность и активизируется во время дифференцировки миобластов C2C12 in vitro и в мышцах раннего постнатального развития [13]. Сохранность митохондрий имеет решающее значение для поддержания функции скелетных мышц [14].

Заключение

Таким образом, в результате исследования икроножной мышцы щенков получены новые данные по морфогенезу мышечной ткани растущих животных. Выявлены особенности цитоархитектоники икроножной мышцы и её стромально-паренхиматозных отношений. Определены параллели по основным стереометрическим параметрам для передней большеберцовой и икроножной мышц. Результаты могут представлять интерес при сравнительном морфологическом анализе в различных экспериментальных моделях.