science-review.ru
Интерфероны – набор биологически активных белков или гликопротеидов, синтезируемых клеткой в процессе защитной реакции на чужеродные агенты (вирусная инфекция, антигенное и митогенное воздействие). На сегодня выявлено свыше 300 различных эффектов интерферонов, среди которых подавление роста внутриклеточных и внеклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы; индукция противоопухолевого ответа; подавление или усиление продукции антител; стимуляция макрофагов; усиление фагоцитоза; активация цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени; усиление презентации по механизму MHC I и II классов; усиление или ингибирование активностей ряда клеточных ферментов; усиление цитотоксического действия двухнитевых РНК; подавление гиперчувствительности замедленного типа. Экспрессия генов интерферонов в основном не является конститутивной, а индуцируется в клетке в ответ на внедрение вирусов и бактерий (или их продуктов). Изучение уровней экспрессии генов, относящихся к системе интерферонов, позволит, например, исследовать состоятельность иммунного ответа при инфицировании вирусами, оценить иммуногенность и реактогенность вакцинных препаратов, проследить формирование специфического клеточно-опосредованного ответа.
Цель исследования – проанализировать современные литературные данные изучения профилей экспрессии интерферон-зависимых генов для диагностики заболеваний иммунной системы.
Материалы и методы исследования
Материалы и методы исследования: зарубежные и российские научные источники по теме «Интерферон-зависимые гены в диагностике заболеваний иммунной системы».
Интерфероны типа 1 (ИФН1), наиболее известными представителями которых являются интерфероны α и β, относятся к семейству цитокинов с противовирусными и иммуномодулирующими свойствами. Основным биологическим свойством ИФН1является способность подавлять синтез вирусных белков, воздействовать на другие этапы репродукции вирусных частиц, включая отпочковывание дочерних популяций. Рекомбинантные интерфероны используются для лечения гепатитов В и С, рассеянного склероза и некоторых опухолей [1]. Оценка влияния вариантов генов интерферона на предрасположенность к хронизации HCV-инфекции показала, что осуществляется взаимосвязь гепатита С с генотипами АА гена OAS1, CC гена OAS3, GG гена PKR, GG гена ИФН-α и ТТ гена ИФН-γ. Носители АА генотипа и аллеля А гена OAS1 наиболее подвержены риску заболевания.
Паттерн-распознающие рецепторы (PRR) усиливают секрецию интерферонов α и β преимущественно в ответ на распознавание вирусных нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). К данным рецепторам можно отнести расположенные в эндосомах: TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, а также цитозольные сенсоры нуклеиновых кислот RIG1, MDA5 и cGAS.
Помимо микробных патогенов, паттерн-распознающие рецепторы могут быть активированы за счет молекул из поврежденных тканей или апоптотических клеток; нарушение распознавания собственных нуклеиновых кислот играет важнейшую роль в развитии аутоиммунных и аутовоспалительных заболеваний [2].
Все ИФН1 связываются с гетеродимерным рецептором IFNAR, который имеется на поверхности клеток. Посредством активации нескольких сигнальных каскадов, в первую очередь канонического пути JAK/STAT, происходит усиление экспрессии ряда интерферонов и интерферон-индуцируемых генов (IFN-responsegenes, IRG) [3]. Точная функция многих из них пока не изучена, однако некоторые, такие как IRF5 и TLR7, стимулируют продукцию интерферона типа 1 [4]. При этом паттерны экспрессии IRG специфичны для определенных типов клеток. Лишь ограниченное число этих молекул гиперэкспрессируется повсеместно и стабильно вне зависимости от того, какой именно стимул вызвал активацию сигнального каскада.
В норме индукция, интенсивность и продолжительность интерферонового ответа строго регулируется. Избыточная активация ИФН1-каскада может приводить к крайне неблагоприятным для организма последствиям – таким как, развитию тромботической микроангиопатии [5]. Нарушение регуляции ИФН1-опосредованного пути лежит в основе патогенеза редких моногенных заболеваний, которые получили название интерферонопатий типа 1. К ним относятся синдромы Айкарди – Гутьерес (прогрессирующая энцефалопатия с дебютом в раннем детском возрасте), Синглтон – Мертен (кардиоваскулярные заболевания с кальцификацией аорты, остеопоретические проявления, зубные и скелетные аномалии, псориатическое поражение кожи), хронический атипичный нейтрофильный дерматоз с липодистрофией и повышением температуры (CAN-DLE), STING-ассоциированная васкулопатия с началом в детском возрасте (SAVI) и т.д. Так же гиперактивация ИФН1-каскада обнаружена при целом ряде аутоиммунных заболеваний многофакторной этиологии, в частности при системной красной волчанке (СКВ), ювенильном дерматомиозите (ЮДМ), системной склеродермии и т.д. [6].
Причины гиперактивации ИФН1-пути. Увеличение секреции ИФН-1 в ответ на вирусную инфекцию зачастую происходит в плазмацитоидных дендритных клетках. Эта активация запускается и за счет эндогенных стимулов, например образования аутоантител и иммунных комплексов, содержащих РНК или ДНК [7]. Генерация аутоантител может быть, в частности, связана с процессом нетоза (NETosis) – разновидности программированной клеточной гибели нейтрофилов с высвобождением так называемых нейтрофильных внеклеточных ловушек (neutrophilextracellulartraps, NET). Деконденсированный хроматин, имеющийся в составе нейтрофильных ловушек, может индуцировать продукцию альфа-интерферона дендритными клетками [8].
Компоненты комплемента в норме осуществляют удаление иммунных комплексов и апоптотических клеток, стимулируя их фагоцитоз моноцитами. При дефиците «ранних» компонентов этой системы иммунные комплексы связываются вместо моноцитов с плазмоцитоидными дендритными клетками, что приводит к активации продукции ИФН1 [9]. В случае моногенных интерферонопатий одним из механизмов гиперактивации ИФН1-пути является повышенная чувствительность сенсоров нуклеиновых кислот – паттерн-распознающих рецепторов (MDA5, RIG-1, STING) – к собственным или чужеродным нуклеиновым кислотам. В частности, роль мутаций гена IFIH1, кодирующего белок–сенсор MDA5, выявляется при целом ряде заболеваний, включая синдром Айкарди – Гутьерес, Синглтон – Мертен, моногенные формы СКВ и т.д. [10].
Кроме того, гиперактивация ИФН1 может наблюдаться при нарушении метаболизма нуклеиновых кислот, например дефекты активности нуклеаз TREX1, SAMHD1, ADAR1, RNASEH2A, RNASEH2B, DNASE1, DNASE1L3 и т.д. В конечном счёте в цитоплазме накапливаются иммуногенные фрагменты собственной ДНК или РНК, которые подвергаются утилизации [11].
В некоторых ситуациях гиперактивация ИФН1 происходит вследствие дефекта молекул, принимающих непосредственное участие в ИФН1-сигнальный путь.
Наконец, существует группа заболеваний, при которых точный механизм гиперактивации интерферонового пути неизвестен. К таким болезням относятся, в частности, синдромы COPA (COatomerProteincomplexsubunitAlpha) и PRAAS (proteasome-associated autoinflammatory syndrome) [12].
Методы детекции интерферонового профиля. Прямая детекция уровня ИФН1 в крови пациентов крайне затруднительна, поскольку его физиологические концентрации очень низки. В связи с этим применение традиционного иммуноферментного анализа (ELISA) невозможно. Показано, что эта проблема может быть преодолена путем использования ультрачувствительной разновидности метода ELISA – Single Molecular Array (Simoa), недавно предложенной компанией Quanterix. Simoa допускает выявление аттомолярной концентрации ИФНα, а также детектирование всех 13 типов ИФНα [13]. Этот метод успешно использовался для мониторинга уровня ИФНα у пациентов с СКВ и идиопатическими воспалительными миопатиями. Однако из-за необходимости приобретения специального оборудования и реагентов ограничивает применение Simoa, поэтому косвенные методы выявления гиперактивации интерферонового пути по-прежнему доминируют.
Впервые повышение экспрессии ряда интерферон-индуцируемых генов было выявлено у пациентов с СКВ с помощью метода РНК-микрочипов [14, 15]. Данный феномен получил название интерфероновой сигнатуры (IFN1 signature, ИФН1-сигнатура, ИФНС). В дальнейшем ряд исследований подтвердил устойчивое наличие характерного паттерна экспрессии ИФН1-зависимых генов у больных с СКВ, а также выявил его присутствие у пациентов с рядом других ревматологических заболеваний (дерматомиозит, системная склеродермия, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, синдром Айкарди – Гутьерес [16, 17]. Несмотря на то, что профиль гиперэкспрессии ИФН1-зависимых генов обладает определенной специфичностью при различных заболеваниях, по-видимому, можно выделить несколько «универсальных» генов, стабильно отражающих наличие активации интерферонового сигнального каскада. После того, как удалось выделить наиболее информативные ИФН1-индуцированные гены, основными методами детекции ИФНС стали количественная ПЦР в реальном времени (с предварительной обратной транскрипцией РНК) и, в меньшей степени, технология NanoString [18]. В отличие от ПЦР в режиме реального времени, метод NanoString основан на прямой гибридизации молекул РНК со специфическими пробами, содержащими уникальные идентификаторы (баркоды); это позволяет снизить погрешности косвенного измерения транскриптов, возникающие на этапе обратной транскрипции. Сравнение ПЦР и NanoString продемонстрировало хорошую конкордантность двух методов; при этом преимуществом NanoString является большая степень автоматизации процесса [19]. В то же время ПЦР, в отличие от NanoString, не является «закрытой» системой и не требует специального оборудования, т.е. оценка ИФН1-сигнатуры может проводиться практически в любой современной молекулярно-генетической лаборатории.
Значительное повышение ИФН1-индекса выявлено при ряде редких интерферонопатий – например, дефиците аденозин-дезаминазы 2 (DADA2), синдромах CANDLE, SAVI [20, 21], системной волчанке [22] – соответственно, данный тест может оказать существенную помощь в диагностике этих состояний. Определение ИФН1-индекса в совокупности с изучением цитокинового профиля и секвенированием нового поколения позволило выделить несколько неизвестных нозологических форм в группе пациентов с недифференцированными системными аутовоспалительными заболеваниями [23].
Некоторые исследователи используют менее универсальные сочетания транскриптов, выделяя индексы IFN-A и IFN-B [24] и добиваясь большей специфичности. Сравнение данных измерения ИФН1-индекса, полученных в разных лабораториях, представляется проблематичным, учитывая использование разных панелей генов, разных исследуемых состояний и разных контрольных групп. Недавнее методологическое исследование показало, что проблему нормализации данных можно решить за счет использования стандартного набора пулированных образцов здоровых индивидуумов, верифицированных методом РНК-секвенирования [25].
На результат также могут повлиять и особенности преаналитического этапа. Для обеспечения сохранности РНК кровь исследуемых помещается в специальные пробирки. По данным некоторых авторов, использование разных преаналитических систем может приводить к различиям в результатах измерения экспрессии [26], в том числе и при оценке экспрессии ИФН-индуцированных генов IFI44L и IFIT1 [27]. В то же время исследование базовой и интерферон-индуцированной экспрессии в цельной крови здоровых доноров свидетельствует о хорошей корреляции между образцами, хранившимися в разных пробирках [28].
Прогностическое значение интерферонового профиля. Исследования транскриптома свидетельствуют, что пациенты с низким и высоким ИФН1-индексом могут различаться в активности течения различных ревматических заболеваний [29]. По всей видимости, развитие ИФН1-сигнатуры является ранним событием в патогенезе СКВ и других аутоиммунных состояний, поэтому величина ИФН1-индекса может иметь прогностическое значение. В частности, из 118 пациентов с повышенным уровнем антинуклеарного фактора (АНФ) и наличием максимум одного симптома СКВ у 14 больных в течение года развилась СКВ и у 5 – первичный синдром Шегрена (аутоиммунное системное поражение соединительной ткани, проявляющееся вовлечением в патологический процесс желез внешней секреции, главным образом слюнных и слёзных, и хроническим прогрессирующим течением). У всех пациентов, развивших аутоиммунное заболевание, уровни IFN-scoreA и, в более значительной степени, IFN-score B оказались выше по сравнению с теми, у кого заболевание не прогрессировало [30]. В то же время в другом исследовании у бессимптомных субъектов, позитивных в отношении наличия антинуклеарных антител, ИФН1-профиль коррелировал с титром антител, но не являлся предиктором развития системного аутоиммунного заболевания [31]. Повышение индекса было значимо ассоциировано с низким уровнем компонентов комплемента С3 и С4, наличием специфических антител и повышенным уровнем IgG, что свидетельствует о более высоком риске прогрессирования заболевания. У пациентов с СКВ повышенный уровень ИФН1-индекса коррелировал с поражением кожи, алопецией и более высокими значениями индекса клинической активности SLEDAI [32, 33].
Связь с активностью ревматических заболеваний. Результаты свидетельствуют, что связь между ИФН1-индексом и клиническими параметрами активности СКВ, системной склеродермии и синдрома Шегрена зависит от уровня экспрессии гена BAFF (B-cell activating factor) [34]. Во многих работах была выявлена связь между активностью кожного поражения при дерматомиозите и наличием ИФН1-сигнатуры [35, 36].
Информация, полученная отечественными ревматологами, свидетельствует о наличии позитивного соотношения между величиной ИФН1-индекса, уровнем экспрессии ИФН1-стимулированного гена EPST11 и длительностью терапии метотрексатом у пациентов с ревматоидным артритом [37].
Подходы к патогенетической терапии. Укоренение важнейшей роли гиперактивации ИФН1-пути в развитии аутоиммунных заболеваний привело к попыткам фармакологического подавления ИФН-сигнатуры. Достаточно успешным оказалось блокирование ИФН1-сигнального каскада с помощью ингибиторов янус-киназ (барицитиниб, тофацитиниб) [38]; мощная иммуносупрессия приводит к развитию оппортунистических инфекций у некоторых пациентов с интерферонопатиями. Применение человеческих моноклональных антител к ИФН-α продемонстрировало неплохие результаты в отношении снижения ИФН1-индекса и снижения показателей активности СКВ и дерматомиозита [39, 40]. Перспективным подходом является непосредственное воздействие на главные продуценты ИФН1 – плазмацитоидные дендритные клетки посредством блокирования лектина BDCA2 (Blood dendritic cell antigen 2), экспрессируемого на их поверхности.
Заключение
Исследование ИФН1-сигнатур является перспективным направлением современной ревматологии. Определение ИФН1-индекса может эффективно использоваться для мониторинга активности как многофакторных аутоиммунных заболеваний, так и редких моногенных интерферонопатий и аутовоспалительных синдромов. С технической точки зрения оценка этого показателя с помощью ПЦР в режиме реального времени обладает хорошей воспроизводимостью и может быть внедрена в любой лаборатории, обладающей соответствующим оборудованием.