Scientific journal

Scientific Review. Biological science

ISSN 2500-3399

ПИ №ФС77-57454

Огромные количества осадков сточных вод, накапливающиеся в городах и промышленных центрах, представляют серьезную экологическую проблему [1]. Чтобы справиться со всем объемом образующихся отходов, нужна промышленная безотходная, экологически чистая технология. Анализ современного состояния почвенного покрова Республики Казахстан, в том числе его плодородия, показал, что в результате экстенсивного использования земельных ресурсов произошли существенные изменения в сторону снижения содержания гумуса в почве и интенсивной деградации и опустынивания земель [2].

Однако несомненным достоинством осадков сточных вод является высокое содержание в них органического вещества, которое может варьировать в пределах 40–75 %, и широкий набор микроэлементов [3]. В связи с чем использование осадков сточных вод в земледелии рассматривается как одно из перспективных направлений их утилизации [1].

С использованием технологии биологического компостирования возможна безопасная и экологически чистая переработка осадка сточных вод в органическое удобрение. Ключевым фактором успешного компостирования является выбор штамма при приготовлении эффективных комплексных микробных препаратов [4]. Широкий спектр микроорганизмов способен расщеплять и окислять макромолекулы. Ведущую роль в превращении органических веществ играют гидролитические ферменты [5]. При компостировании микроорганизмы используют как внеклеточные, так и внутриклеточные ферменты для гидролиза органических веществ и превращения сложных соединений в простые молекулы которые могут быть ассимилированы и, наконец, минерализованы [6]. Поиск новых штаммов, которые позволили бы сократить продолжительность биологической переработки отходов и в то же время обеспечить получение полноценного конечного продукта (например, компоста) или отходов, отвечающих требованиям законодательства (например, стабилизированных отходов), в настоящее время является одной из актуальных задач.

Целью данной работы является изучение, выделение и отбор штаммов, перспективных для переработки осадков сточных вод.

Материалы и методы исследования

Выделение чистых культур микроорганизмов проводили поэтапно: получение накопительной культуры; выделение чистой культуры; определение чистоты и определение ферментативной (протеолитической, липолитической, амилолитической и уреазной, целлюлолитической) активности [7].

Штаммы бактерий идентифицировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрией при идентификации микроорганизмов на масс-спектрометре Microflex LT («Bruker Daltonics», Германия). Использовалась коммерческая база данных (MALDI Biotyper 4.0, Bruker Daltonics) согласно инструкции производителя.

Результаты исследования и их обсуждение

Производство осадка сточных вод в Казахстане составляет около 5 млн т в год, и этот объем постоянно увеличивается с увеличением населения страны. Поскольку осадок сточных вод может содержать вредные компоненты, такие как патогенные организмы, органические соединения, избыток фосфора и азота, неправильное обращение с ним может иметь много неблагоприятных последствий для окружающей среды. Одним из методов биоконверсии органических отходов в экологически чистое удобрение является компостирование. В ускорении процесса компостирования органических отходов существенную роль играют микроорганизмы, продуцирующие гидролитические ферменты (амилаза, протеаза, целлюлаза, липаза, уреаза), ответственные за разложение органических соединений [8]. В статье представлены данные по характеристике ферментативного потенциала бактерий, выделенных из осадка сточных вод канализационно-очистных сооружений г. Нур-Султан, Рудный, Форт-Шевченко, дачной почвы и свежескошенной травы с дачного участка (г. Нур-Султан), для переработки органических отходов и выявления активных штаммов.

Выделение микроорганизмов проводили методом накопительных культур на жидких питательных средах с последующим высевом на плотные среды для изолирования отдельных колоний (рис. 1).

Чистые культуры аэробных микроорганизмов пересевали на плотные питательные среды: СПА, МРС-4, трехсахарный агар, Гетчинсона, Macconkey, Hottinger, Pseudomonas методом истощающего штриха по Гоулду. Чистоту выделенных культур микроорганизмов оценивали микроскопическим контролем по Граму. В результате проведенных экспериментов выделено 60 микроорганизмов (рис. 2), из которых 3 были термофильными (DS1, DS2 и DS3).

Рис. 1. Накопительная культура

Рис. 2. Количество изолятов, выделенных из разных источников

Наибольшее количество изолятов выделено из иловых осадков и сточных вод г. Рудный ОС «Рудненский водоканал» и г. Нур-Султана ГККП «Астана су арнасы», 21 и 18 культур соответственно. Из сточных вод КОС г. Форт-Шевченко выделено 7 изолятов. Наименьшее количество изолятов отобрано из дачной почвы г. Нур-Султана и свежескошенной травы – 9 и 5 соответственно.

Для выбора перспективных микроорганизмов для переработки ОСВ выделенные штаммы бактерий были протестированы на ферментативные свойства (табл. 1) – липолитическую, протеолитическую, амилолитическую, целлюлолитическую, уреолитическую и нефтеокисляющую активность.

По результатам экспериментов гидролиз крахмала (амилолитическая активность) обнаружен у 2 изолятов – СВ2/2, СВ2/1, по наибольшей способности расщеплять казеин отобраны 3 культуры – СВ2, СВ2/1, СВ1/1. Из 60 культур максимальной способностью расщеплять жиры обладали 3 культуры – СВ3, СВГ1/1, ИЛ3. Данные изоляты были отобраны для дальнейшей работы.

Таблица 1

Ферментативная активность изолятов

В результате скрининга отобраны 7 штаммов активных, обладающих целлюлозолитической активностью (DS1, DS2, ИЛ3, ИЛ5, П2, П5, П3).

Способностью к быстрому разложению мочевины обладали 6 культур. Изолят П1 отобран по средней способности расщеплять казеин и целлюлозу. Изолят DS3 является термофильным и обладает целлюлозолитической активностью, поэтому также отобран для дальнейших исследований.

Таким образом, на основе проведенных исследований было отобрано 15 изолятов – СВ2, СВ3, СВ1/1, СВ2/2, СВГ1/1, СВ2/1, DS1, DS2, DS3, ИЛ3, ИЛ5, П1, П2, П5, П3.

В табл. 2 и 3 представлены культуральные свойства отобранных микроорганизмов.

Таблица 2

Макро- и микроскопия отобранных изолятов

Таблица 3

Культуральные свойства изолятов

Таблица 4

Идентификация штаммов по Мaldi-TOF

Примечание: диапазон идентификации: 2,300–3,000 и более – высокая степень идентификации, 2,000–2,299 – вероятная идентификация вида, 1,700–1,999 – вероятная идентификация рода, 0,000–1,699 – идентификация невозможна

Большая часть отобранных изолятов грамположительные, 4 изолята – грамотрицательные. СВГ1/1 и DS1 имели кокообразную форму клеток, все остальные изоляты имели палочковидную форму клеток. Рост всех изолятов на плотных питательных средах отличается по размеру, форме колоний, цвету, текстуре, профилю, поверхности и краю колоний.

Спорообразование наблюдалось у 6 изолятов: СВ1/1, СВ2, СВ2/1, DS2, DS3, П1. Из отобранных культур 3 изолята способны к росту при температуре выше 45 °С, при 28 °С рост клеток останавливался. Для остальных культур оптимальным для роста является диапазон температур 28–37 °С.

Идентификация (табл. 4) отобранных микроорганизмов на масс-спектрометре (Maldi-TOF) выявила принадлежность выбранных штаммов к роду Rhodococcus rhodochrous – СВ 3, 2 штамма – СВ2, СB1/1 – Bacillus cereus, СВ 2/2 – Cryseobacterium arachidis, СВГ 1/1 – Pseudoxanthomonas sp., СВ2/1 – Bacillus megaterium, DS1 – Pediococcus acidilactici, DS2 – Paenibacillus residui, DS3 – Brevibacillus invocatus, 3 штамма ИЛ3, П5, П3 – Enterobacter cloacae, 2 штамма ИЛ5, П2 – Ochrobactrum intermedium, П1 – Bacillus lichenoformis.

Среди отобранных бактерий рода Bacillus представлен видами Bacillus cereus, B. megaterium, B. lichenoformis. Члены этого рода образуют эндоспоры, устойчивые к высоким температурам, коррозии и пагубным параметрам окружающей среды, они могут расти и размножаться даже при 80 °C и являются важными микроорганизмами в процессе компостирования [9].

Практически все представители отобранных видов микроорганизмов известны как активные разрушители органических веществ. Данные бактерии являются перспективными для дальнейшей переработки осадков сточных вод в органическое удобрение.

Заключение

Таким образом, из сточных вод КОС г. Нур-Султан, Рудный, Форт-Шевченко, дачной почвы и свежескошенной травы с дачного участка (г. Нур-Султан) выделено 60 изолятов. В процессе скрининга было отобрано 15 активных изолятов, установлена их видовая принадлежность. Отобранные штаммы будут использованы при создании эффективного биопрепарата для компостирования иловых осадков сточных вод.