Scientific journal

Scientific Review. Biological science

ISSN 2500-3399

ПИ №ФС77-57454

Одним из наиболее актуальных вопросов при производстве биопрепаратов на основе микроорганизмов является концентрирование биомассы, осажденной флокулянтами. Исследования по осаждению с использованием флокулянтов при производстве биопрепаратов в Узбекистане практически не проводились. Поэтому разработка технологических параметров осаждения биомассы флокулянтами при получении сухих препаративных форм, поиск соотношения концентрированного биопрепарата с флокулянтом, изучение влияния новой препаративной формы фитостимулирующих свойств на всхожесть семян, определение антагонистической активности против грибов-фитопатогенов и урожайности растений является актуальным вопросом.

На практике широко применяют различные препаративные формы при использовании микроорганизмов, в том числе жидкие культуры, гелевые субстратные носители (бактериальные экзополисахариды, силикагель, высокодисперсные материалы) и твердые носители (вермикулит, лигнил, перламутр, торф и др.). Микроорганизмы, составляющие основу биопрепаратов, должны отвечать ряду требований и обладать определенными характеристиками, такими как вирулентная активность, эффективность, конкурентоспособность, технологичность (способность набирать определенный титр в стандартных и производственных условиях). Основными требованиями к биопрепаратам являются: высокий титр активных клеток, необходимый срок хранения, транспортабельность, технологичность (растворимость, хранение в семенах и др.), колонизация в почве или на поверхности растения, а также их дешевизна [1-4].

Состав биоинокулянта на твердой или жидкой основе включает добавление средств защиты клеток, таких как глицерин, лактоза, крахмал, хороший материал-носитель, надлежащую упаковку и наилучшие способы доставки.

Недавние разработки рецептур основываются на микроинкапсуляции, наноиммобилизации микробных биоинокулянтов и биоудобрений на основе биопленки и других пленкообразующих соединений [5-7].

Для приготовления инокулята используют средства защиты клеток, такие как глицерин, лактоза, крахмал, а также хороший материал-носитель, надлежащая упаковка и наилучшие способы транспортировки. Для жидкофазной ферментации использует сепарацию, осаждение, флотацию, вакуум-конденсацию или мембранные технологии [1-3].

В случае приготовления жидких и сухих биопрепаратов увлажняющий порошок получают различными способами путем сушки концентрата, полученного из культуральной жидкости, постепенно до получения концентрированной формы и стандартизируют пасту до эталона в виде консервированного готового продукта. В случае получения готового продукта используются эмульгирующие пасты, дусты, гранулы, таблетки и микрокапсулы, которые изготавливаются на основе полимеров, широко используемых в медицине и в фармацевтике. В состав всех видов биопрепаратов входят вещества, обеспечивающие определенные физико-химические свойства, такие как вязкость, влагосодержание, устойчивость к начальной активности и УФ-лучам, продолжительность воздействия и др. [4; 5].

А также в последние годы широко применяется иммобилизация штаммов-продуцентов в носителях различного состава. В таких методах гранулированные и порошкообразные биопрепараты получают путем внедрения или иммобилизации на твердых природных сорбентах. Торфяная форма ряда препаратов, служащих для повышения плодородия почвы, уже несколько лет используется в сельскохозяйственной практике (Экстрасол, Ризоторфин, Агрофил и др.). Технология их получения значительно проще, не требует больших затрат, питательная среда позволяет микроорганизмам активно размножаться длительное время, не теряя жизнеспособности [1-3].

Иммобилизацию ризобактерий проводят инстилляцией альгинатно-крахмального раствора с примесью ризобактерий в раствор кальция, и этот процесс анализируют, исходя из стадии роста бактерий, природы осмопротекторов и раствора кальция. Максимальное восстановление клеток наблюдалось при выращивании Raoultella в среде, наполненной глюконатом кальция в качестве агента терригена. Также было отмечено, что высушенный препарат, содержащий Azospirillum brasilense, сохранял жизнеспособность для 76% клеток в течение года. Выживаемость ризобактерий при биоинкапсулировании можно улучшить, добавляя к препарату крахмал, изменяя фазу роста клеток и применяя органическое соединение тегалозу в питательной среде [1-4].

Цель исследования: разработать технологию получения биопрепарата на основе ризобактерий, иммобилизированных в органический полимер Гипан.

Материалы и методы исследования

В качестве материала исследования использовали штаммы Pseudomonas stutzeri СКБ 308, Bacillus megaterium СКБ 310, Bacillus subtilis СКБ 309, выделенные в наших предыдущих исследованиях, входящие в состав биопрепарата «Замин-М». На основе ассоциации этих штаммов получен авторский патент Агентства интеллектуальной собственности Республики Узбекистан (АПИАП 05254. 16.01.2014).

Для флокуляции ризобактерий использовали флокулянт Gipan. Он представляет собой частично гидролизуемый полиакрилонитрил, который хорошо растворяется в воде. Обычно используют раствор 9-12% в воде. Цвет варьируется от светло-желтого до темно-коричневого. Плотность при t -200 °С колебалась от 1,06 до 1,07 г/см3, рН 8-9. Не замерзает при – 5-10 °C [8]. Гидрогель использовали для иммобилизации в составе биопрепарата.

Гидрогель представляет собой синтетический полимер, стойкий к воздействию воды. Он обладает способностью поглощать большое количество воды и при необходимости выделять проглоченную воду во внешнюю среду.

Рис. 1. Гипан

Флокулянт Гипан (рис. 1) любезно предоставлен старшим научным сотрудником Ташкентского научно-исследовательского химико-технологического института Общества с ограниченной ответственностью д.т.н. PhD Шириновым Шавкатом Давлетовичом.

Результаты исследования и их обсуждение

Известно, что процесс концентрирования биомассы микроорганизмов с помощью флокулянтов осуществляют в технологическом процессе ферментации бактерий после стадии роста ферментов в культуральной жидкости.

Существует три основных метода концентрирования биомассы: вакуумное выпаривание, микрофильтрация культуральной жидкости и осаждение биомассы из культуральной жидкости с использованием флокулянтов. В каждом из рассмотренных методов есть специфичная себестоимость препарата, которая делится на капитальные и эксплуатационные затраты, затраты на приобретение сырья, которое рассчитывается для промышленного производственного процесса.

Установлено, что одним из этих способов является отделение биомассы путем седиментации как один из наименее затратных способов [1]. Поэтому в данном исследовании были проведены исследования по использованию флокулянта Гипан, имитирующего условия засоления, подходящие для условий Узбекистана, для осаждения и концентрирования биомассы при производстве биопрепаратов на основе ризобактерий.

Начальные этапы исследования концентрации биомассы микроорганизмов основывались на использовании полиакролонитрила – Гипан для флокуляции культур штаммов ризобактерий биопрепарата «Замин-М», растущих при рН-8, в следующих соотношениях: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5%.

Преимуществом данного полимера является то, что его полимеризация происходит при рН 7-8, что связано с тем, что штаммы ризобактерий биопрепарата «Замин-М», адаптированные к условиям солевого стресса, соответствуют условиям развития в щелочной среде. Еще одним преимуществом полимера является то, что он не замерзает при температуре -5-10 °С, что позволяет клеткам сохраняться живыми длительное время. На следующем рисунке представлены сведения о влиянии Гипана на седиментацию бактериальных клеток (рис. 2).

Рис. 2. Влияние Гипана на седиментацию бактериальных клеток

Как видно из рисунка 2, плотность надосадочной жидкости клеток, преципитированных с концентрацией Гипана 0,1%, составила 0,070968 мг/л, с концентрацией Гипана 0,2% 0,092487, 03% 0,97640, 04% 0,81941, 0,5% до 1,06351 мг/л. Концентрация Гипана 0,1% явилась причиной осветления осадочной жидкости, остальная биомасса осаждалась с трудом, увеличение концентрации Гипана приводило к загущению полимера с биомассой.

Контроль оптической плотности осветленной культуральной жидкости определяли относительно отцентрифугированного надосадочного раствора. Экспериментальные результаты показывают, что седиментация биомассы существенно различается при разных значениях концентрации реагента Гипан. Это связано с увеличением вязкости культуральной жидкости, что не привело к отложению образовавшихся флокул, или может быть связано с зарядами или морфологическими свойствами клеток микроорганизма, или составом, физико-химическими свойствами культуры, жидкости.

Так, при использовании процесса флокуляции для ассоциации микроорганизмов «Замин-М» оптимальная концентрация флокулянта по отношению к культуральной жидкости составила – 0,1%, а продолжительность периода седиментации 90 минут, которая привела к осаждению 90% биомассы. Оптимальное соотношение флокулянта привело к стабильности и жизнеспособности микроорганизмов в осаждаемой биомассе.

Кроме того, для иммобилизации осажденной биомассы микроорганизмов биопрепарата «Замин-М» использован гидрогель с концентрацией 0,01, 0,06, 0,1, 0,5% (рис. 3). Исследования по отношению количества клеток, осажденных гипановым полимером, показали, что жизнеспособность клеток была самой высокой при концентрации 0,1%. Флокулянт Гипан разбавляли 2–7 объемами воды для введения в KЖ. Затем смесь KЖ и флокулянта перемешивали в течение 2 минут, чтобы компоненты раствора полностью перемешались и кусочки собрались вместе. Седиментацию проводили при комнатной температуре и pH 9,0 культуральной жидкости (рис. 3).

Контроль оптической плотности осветления культуральной жидкости определяли относительно центрифугированного супернатанта.

Как видно из рисунка 3, оптимальной концентрацией иммобилянта оказался вносимый гидрогель в количестве 0,06% по отношению к культуральной жидкости до осаждения 90% КЖ.

Время осаждения биомассы составляла 90 минут. В этом опыте титр микроорганизмов в осадке составил 3х10 -КОЕ, его содержание в надосадочной жидкости не превышало 0,96592-мг/л (рис. 4).

Рис. 3. Результаты спектрофотометрического анализа осаждения биомассы микроорганизмов, составляющих биопрепарат «Замин-М», путем иммобилизации в гидрогель

А Б Риc. 4. Колония клеток биопрепарата «Замин-М» осаждается Гипановым флокулянтом. Общий вид колоний, осажденных А-0,1% Гипаном и В-0,2% Гипаном

Срок хранения сухой формы биопрепарата «Замин-М» в каолиновой смеси Гипан

Результаты эксперимента по осаждению биомассы при различных значениях концентрации реагента Гипан значительно различаются. Это связано с увеличением вязкости культуральной жидкости, что не вызвало отложения образовавшихся флокул, или это могло быть обусловлено зарядом или морфологическими свойствами клеток, или их составом, физико–химическими свойствами культуральной жидкости.

Следующие исследования основывались на изучении процесса иммобилизации ризобактерий в твердый носитель, являющийся основой биопрепарата «Замин-М» (таблица). Массу препарата, состоящую из иммобилизованных клеток в виде сухого порошка, смешивали с каолином в соотношении 100:1; 100:2, 100:3; 100:4 и 100:5, после того сушили в сушилке.

Как видно из таблицы, был выбран каолин в качестве наполнителя в соотношении 100:5, при котором концентрация клеток составила 3,6х107 через 3 месяца, 3,0х109 через 6 месяцев и 3,0х109 через 1 год. Вышеуказанный способ консервации зарекомендовал себя как эффективное средство обеспечения сохранности специфических свойств микроорганизмов благодаря удобству и дешевизне. Поэтому оптимальным вариантом считалось соотношение 100: 5 при производстве сухого биопрепарата «Замин-М».

Выводы

Высокомолекулярный реагент Гипан для флокуляции биомассы имеет 3 положительные функции: первая – эффективный флокулянт, вторая – удобное и недорогое средство защиты от микроорганизмов при хранении, поддерживающее практически неизменный титр и жизнеспособность, а главное, сохраняется антагонистическая активность в отношении фитопатогенов, а также увеличение роста и развития растений, что приводит к сохранению урожая. По результатам эксперимента подобрано соотношение каолин:биомасса – 100:5.

Увеличение биомассы не оказывает существенного влияния на количество микроорганизмов в сухой форме препарата, но экономически неэффективно. На основе экспериментальных данных был разработан опытный образец сухого биопрепарата «Замин-М».