Scientific journal
Scientific Review. Biological science
ISSN 2500-3399
ПИ №ФС77-57454

ISOLATION OF HYDROLYSIS BACTERIA FROM A BIOGASEQUIPMENT WORKING ON CATTLE MANURE AND STUDIIND OF THEIR ENZYMATIC ACTIVITY

Moldagulova A.K. 1, 2 Anuarbekova S.S. 1 Moldagulova N.B. 1, 2 Kulmagambetova R.Kh. 1 Sarsenova A.S. 1, 2 Kurmanbaev A.A. 1
1 Eсostandart.kz LLP
2 LLP «Scientific and Production Center of ecological and industrial biotechnology
This paper presents the results of isolation and screening of hydrolytic microorganisms for biogas production. Efficient biogas production is based on a complex microbiological process, the first stage of which is the hydrolysis of organic substances. From a laboratory single-chamber BU with a working volume of 10 l, using cattle manure as a substrate, and cow manure by inoculation on various elective nutrient media (SPA, MPA, Saburo, MRS), 18 pure isolates were isolated. The cultural and morphological features and viability of isolated microorganisms were studied. Next, screening of microorganisms was carried out according to their hydrolytic activity: amylolytic, proteolytic, cellulolytic, urease, lipase. The maximum GSP index varied within 106-108 CFU/ml. The study of the enzymatic activity of the obtained isolates, namely the activity of hydrolases, showed that 12 isolated cultures have proteolytic activity. Only 2 isolates had amylolytic activity, 11 isolates had the highest cellulolytic activity. 4 isolates had the ability to decompose urea to ammonia. 3 isolates showed lipolytic activity. As a result of the genetic identification of the selected isolates by MALDI-TOF, the isolated microorganisms were assigned to Ochrobactrum tritici, Bacillus pumilus, Pseudomonas citronellolis, Lysinibacillus sphaericus, Acinetobacter johnsonii, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli.
cattle manure
microorganisms
biogas plant
enzymatic activity

Животноводческие отходы являются источником загрязнения воздуха и водных ресурсов. Однако при правильном управлении данным видом отходов они могут служить энергетическим ресурсом [1].

Путем анаэробного сбраживания из животноводческих отходов получают биогаз. Использование навоза для получения биогаза имеет ряд достоинств, например производство энергии без ископаемого топлива, повторное использование питательных веществ и сокращение выбросов парниковых газов в сельском хозяйстве [2]. Потенциал производства биогаза из животноводческих отходов в Казахстане в целом высок, поэтому существует необходимость развития данной отрасли.

Животноводческие отходы имеют высокое содержание воды и клетчатки, что приводит к малым выработкам биогаза и эффективности разложения, что в свою очередь препятствует более широкому использованию биогазовой технологии в сельском хозяйстве [3]. Более того, патогенные микроорганизмы, которые могут встречаться в составе навоза, являются барьером для использования переработанного навоза в качестве удобрения [4]. Добавление специально подобранных микроорганизмов в животноводческие отходы позволит увеличить выход биогаза и снизить количество патогенных микроорганизмов.

В первой фазе анаэробного брожения активизируются гидролизные микроорганизмы. В этой фазе сложные органические вещества распадаются на простые водорастворимые соединения, которые могут поглощаться микробными клетками. Сложные макромолекулы, такие как углеводы, белки и жиры соответственно, превращаются в моносахариды, аминокислоты и жирные кислоты. Это происходит за счет ферментативного гидролиза, в котором различные факультативные и/или облигатные анаэробные гидролитические бактерии выделяют экзоферменты, которые способствуют расщеплению ковалентных связей в субстрате в результате химической реакции с водой. Ферменты, участвующие в процессе гидролиза, называют гидролазами. Разные гидролазы синтезируются специфичными видами гидролитических бактерий для деградации различных макромолекул. Например, целлюлозолитические бактерии синтезируют целлюлазу для гидролиза целлюлозы, в то время как липолитические бактерии синтезируют липазы для гидролиза жировых молекул. Гидролиз неструктурных углеводов происходит быстро, порядка нескольких часов, в то время как гидролиз белков и жиров может продолжаться до нескольких дней [5].

Гидролизные микроорганизмы играют очень важную роль в процессе получения биометана. Целью нашей работы явилось выделение и изучение гидролизных бактерий из субстрата биогазовой установки (БУ), работающей на навозе крупного рогатого скота (КРС), и навоза КРС.

Материалы и методы исследования

Изоляты микроорганизмов выделяли из субстрата БУ (навоза) с использованием общепринятого в бактериологической практике метода, который проходит в три этапа: получение накопительной культуры; выделение чистой культуры; определение чистоты выделенной культуры [6].

Для выделения мезофильных бактерий инкубацию субстрата БУ производили при 37 °С в течение 24 ч. Для выделения термофильных бактерий инкубацию субстрата производили при 45 °С – 24 ч. Для получения изолятов микроорганизмов выросшие колонии пересевали методом истощающего штриха по Голду.

Чистота выделенной культуры микроорганизмов тщательно проверялась. При визуальном контроле просматривался рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной среды.

Оценку максимального показателя жизнеспособности (ЖСП) проводили методом Miles&Misra [7] с целью получения жизнеспособных культур с показателем 106–107 КОЕ/мл и более.

Скрининг выделенных изолятов проводили на основе изучения ферментативной активности путем определения амилолитической, протеолитической, целлюлолитической, липазной и уреазной активностей.

Проведена идентификация микроорганизмов c использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex («BrukerDaltonics», Германия). Полученные белковые спектры сравнивали с эталонными спектрами, имеющимися в базе данных BrukerDatabaseVersion 3.3.1.0, используя программное обеспечение Biotyper [8].

Результаты исследования и их обсуждение

Из лабораторной однокамерной БУ с рабочим объемом 10 л, в качестве субстрата использующей навоз КРС, и коровьего навоза путем посева на различные элективные питательные среды (СПА, МПА, Сабуро, МРС) было выделено 18 чистых изолятов. Из них один изолят был способен расти при температуре 45 °С, а остальные при 37 °С. Все выделенные объекты, по культурально-морфологическим признакам отнесены к бактериальным культурам.

Рост всех изолятов на плотных питательных средах отличался по форме колоний, цвету, текстуре, профилю, поверхности и краям колонии (табл. 1).

На рис. 1, а, представлена колония изолята В3: колония кремового цвета, поверхность матовая, края неровные; на рис. 1, б – изолят В6: колония бежевого цвета, поверхность гладкая, блестящая с неровными краями.

С помощью микроскопии окрашенных по Граму мазков было определено, что в исследуемых образцах присутствуют грамположительные микроорганизмы в форме палочек с закругленными концами, разных размеров, образующих или не образующих спор, расположенные одиночно, попарно, в цепочку или скоплениями. На рис. 2 представлена микроскопия некоторых выделенных чистых изолятов. Изоляты чистые, однородные.

Таблица 1

Культурально-морфологические свойства изолятов

Изолят

Размер,

мм

Форма

Поверхность

Край

Цвет

Рост в жидкой среде

ЖСП

1

№ 846

2–3

НП

М

Р

Б

МНБО

107

2

№ 847

3–5

К

Г

Р

Б

МНБО

108

3

№ 848

1–3

НП

Г

Н

Б

МНПП

108

4

№ 849

1–3

К

Г

Н

Б

МНБО

108

5

№ 850

1–3

НП

Г

Н

С

МНПП

108

6

№ 851

2–5

К

М

Р

С

МО

107

7

№ 852

2–4

К

Г

Р

Б

МНПП

108

8

№ 853

2–5

К

Г

Р

Б

МНПП

108

9

№ 854

1–3

К

М

Н

Б

МО

108

10

№ 855

1–3

К

Г

Н

С

МО

108

11

№ 856

2–4

К

Г

Р

Б

МО

107

12

№ 857

2–5

К

Г

Р

Б

МО

107

13

№ 858

2–3

К

Г

Н

Б

МО

108

14

В3

2–4

К

М

Н

Б

МО

106

15

В4

2–3

К

Г

Н

К

МО

106

16

В5

2,5–3

К

Г

Н

К

МО

106

17

В6

2–3

НП

М

Н

Б

МНПП

106

18

В7

2–5

НП

М

Н

Б

МНПП

106

Примечание. К – круглая, НП – неправильная, Г – глянцевая, М – матовая, Р – ровная, Н – неровная, Б –беловатая, С – серая, МО – мутность, осадок, МНБО – мутность, небольшой осадок, МНПП – мутность, на поверхности пленка

missing image file

а б

Рис. 1. Рост колоний изолятов В3 (а) и В6 (б) на питательной среде СПА

missing image file

Рис. 2. Микроскопическая картина изолятов (по Граму), ×100: а) 855, б) 858, в) В4

Одной из характеристик скрининга является отбор микроорганизмов для дальнейшей работы по максимальному показателю ЖСП, чтобы иметь клетки с хорошей выживаемостью в различных условиях.

Всего из БУ и навоза КРС было получено 18 чистых культур. Из них 13 культур выделены из БУ (№ 846, № 847, № 848, № 849, № 850, № 851, № 852, № 853, № 854, № 855, № 856, № 857, № 858) и 5 чистых культур из навоза КРС: В3, В4, В5, В6, В7. Максимальный показатель ЖСП варьирует в пределах 106–108 КОЕ/мл.

Изучение ферментативной активности полученных изолятов, а именно активности гидролаз, показало, что 12 выделенных культур обладают протеолитической активностью: 846, 848, 850, 852, 853, 854, 856, 857, В3, В5, В6, В7. Наиболее активными были изоляты № 854, В6. Протеолитические ферменты (протеазы) катализируют расщепление белков на поли- и олигопептиды. Протеазы выделяются различными видами бацилл, актиномицетов, мицелиальных грибов и другими микроорганизмами. Активность внеклеточных протеаз определяли, используя в качестве субстрата желатин и казеин [9].

Амилолитической активностью обладали только два изолята – В5 и В6. Целлюлозу разлагали 11 культур: 846, 848, 852, 853, 854, 855, 856, 858, В3, В5, В6.

Способность разложения мочевины до аммиака отмечена у следующих изолятов: 846, 847, 849, В6. Уреаза – фермент, участвующий в регуляции азотного обмена в почве. Этот фермент катализирует гидролиз мочевины до аммиака и углекислого газа, вызывая гидролитическое расщепление связи между азотом и углеродом в молекулах органических веществ [10].

Липолитическую активность проявляли изоляты 846, 851 и 857. Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. Для выявления липолитической активности использовали твины [11].

Результаты представлены в табл. 2.

На рис. 3 представлены фотографии изолятов с протеолитической, амилолитической, целлюлозолитической, уреолитической и липолитической активностями.

Таблица 2

Ферментативная активность изолятов

Изоляты

Амилазная активность

Протеализ казеин

Целлюлаза

Уреазная активность

Липаза

№ 846

-

+

+++

+++

+++

№ 847

-

-

-

+++

-

№ 848

-

+

+++

-

-

№ 849

-

-

-

+++

-

№ 850

-

+

-

-

-

№ 851

-

-

-

-

+

№ 852

-

+

+++

-

-

№ 853

-

+

+++

-

-

№ 854

-

++

+++

-

-

№ 855

-

-

+++

-

-

№856

-

+

+++

-

-

№857

-

+

-

-

+

№858

-

-

++

-

-

В3

-

+

+++

-

-

В4

-

-

-

-

-

В5

+

+

+++

-

-

В6

+

+++

++

+

-

В7

-

+

-

-

-

Примечание:

- – отсутствие активности

+ – активность выражена слабо

++ – средняя активность

+++ – высокая активность

missing image file

Рис. 3. Ферментативная активность выделенных культур микроорганизмов: а – протеолиз (В6 и В7), б – амилолитическая (В5 и В6), в – целлюлозная (853, 854, 855), г – уреазная (846, 847, 849), д – липолиз (846)

Таблица 3

Видовая принадлежность изолятов (Maldi-TOF, Bruker)

Наименование культур

Источник выделения

Идентификация Maldi

Диапазон идентификации*

№ 846

Субстрат с БУ

Ochrobactrum tritici

1.888

№ 847

Субстрат с БУ

Ochrobactrum tritici

1.882

№ 848

Субстрат с БУ

Bacillus pumilus

1.864

№ 849

Субстрат с БУ

Pseudomonas citronellolis

2.298

№ 851

Субстрат с БУ

Lysinibacillus sphaericus

2.152

№ 852

Субстрат с БУ

Bacillus pumilus

1.975

№ 853

Субстрат с БУ

Bacillus pumilus

1.905

№ 854

Субстрат с БУ

Bacillus pumilus

2.003

№ 855

Субстрат с БУ

Lysinibacillus sphaericus

2.107

№ 856

Субстрат с БУ

Bacillus pumilus

1.922

№ 857

Субстрат с БУ

Acinetobacter johnsonii

1.926

№ 858

Субстрат с БУ

Bacillus cereus

1.712

В3

Навоз КРС

Bacillus subtilis

2.108

В5

Навоз КРС

Escherichia coli

2.398

В6

Навоз КРС

Bacillus cereus

2.344

На основе полученных данных нами были отобраны наиболее активные гидролитические изоляты, которые были идентифицированы по методу MALDI-TOF. Из 18 изолятов для дальнейшей работы отобрано 15 изолятов, обладающих наиболее высокими ферментативными свойствами. Результаты идентификации активных изолятов микроорганизмов методом масс-спектрометрии представлены в табл. 3.

Результаты идентификации по MALDI-TOF, с высокой степенью идентификации штаммов с гомологией нуклеотидной последовательности 98–100 %.

В результате проведения генетической идентификации отобранных изолятов по MALDI-TOF выделенные микроорганизмы отнесены к Ochrobactrum tritici, Bacillus pumilus, Pseudomonas citronellolis, Lysinibacillus sphaericus, Acinetobacter johnsonii, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli.

Заключение

В Казахстане очень остро стоит проблема переработки животноводческих отходов. Эту проблему можно решить путем анаэробной ферментации с применением ферментативно активных микроорганизмов для ускорения процесса. В результате проведенных исследований из БУ и навоза КРС были выделены различные микроорганизмы. Изучены их культурально-морфологические и физиологические свойства. Отобрано 15 активных штаммов микроорганизмов для создания заквасок с целью бесперебойной работы БУ.

Ценность полученных данных заключается в получении из активных штаммов бактерий, перспективных для ускоренной переработки органических отходов и получения метана. Данные могут стать толчком для разработки новой отечественной микробной добавки для анаэробной ферментации органических отходов.