Введение

На сегодняшний день взаимосвязь развития сахарного диабета СД 1 типа (СД1) и особенно 2 типа (СД2) с нарушением функции печени бесспорна. Это связано с тем, что печень, являясь «главной биохимической лабораторией» всего организма, непосредственно участвует практически во всех обменных процессах, и это отражается в той или иной степени на патогенетических звеньях развития заболеваний. Одной из главных функций печени является детоксицирующая функция, связанная с цитохром Р-450 зависимой монооксигеназной системой (МОС), локализованной в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов. В этой системе протекает огромное количество метаболических реакций, направленных на изменения структуры как ксено-, так и эндобиотиков [1], поэтому ее активность должна играть существенную роль в развитии такой метаболической болезни, как СД. Причем в настоящее время даже появился термин «гепатогенный сахарный диабет» [2]. Известно, что инсулин выводится из циркулирующей крови от 50 до 80 % путем расщепления в печени. В то же время выявлена значительная вариабельность доли инсулина, выводимого печенью (от 20 до 80 %). В случае сниженного печеночного клиренса будет наблюдаться гиперинсулинемия, что в конечном итоге может привести к развитию СД2 [3]. Данные исследования указывают на связь между функциональным состоянием печени и развитием, а также степенью тяжести СД. Нас интересовал вопрос о степени тяжести СД в зависимости от фенотипа активности микросомальных оксидаз и было показано наличие такой связи: у быстрых метаболизаторов при аллоксановом СД степень нарушения углеводного обмена оказалась выше, чем у средних и медленных метаболизаторов [4]. В связи с индуцибельностью системы микросомальных оксидаз гепатоцитов возник закономерный вопрос о влиянии препаратов-индукторов микросомальных ферментов на риск развития и тяжесть течения СД.

Цель исследования – оценка степени развития аллоксанового диабета у крыс при предварительном введении индуктора монооксигеназных ферментов – бензонала (бензобарбитала).

Материалы и методы исследования

Для проведения экспериментов изначально были выбраны 120 белых крыс-самцов с исходной массой тела от 140 до 319 г (среднее 191 ± 3,99 г). Содержание животных и все остальные экспериментальные процедуры проводились согласно руководству «The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research» [5]. Фенотипирование животных по активности МОС печени проводилось на основе оценки длительности нембуталового сна. Животным внутрибрюшинно вводили нембутал (пентобарбитал) в дозе 40 мг/кг массы тела. Время наркотического сна рассчитывали в минутах, и по результатам крыс разделили на быстрых, средних и медленных метаболизаторов. Для опытов, через месяц после фенотипирования, из группы животных с умеренной скоростью метаболизма формировали выборку из 24 крыс методом случайного отбора. У всех отобранных крыс брали кровь для исследований, по результатам которых определили интактный уровень показателей. Далее крысы были разделены на две группы. Опытная группа (12 крыс) – получала перорально через зонд бензонал в крахмальном клейстере (для равномерного распределения препарата, нерастворимого в воде) в дозе 50 мг/кг массы тела, в течение трех дней. Контрольная группа (12 крыс) в течение трех дней получала соответствующий объем крахмального клейстера. Экспериментальный СД у всех 24 крыс моделировался внутрибрюшинным введением аллоксана моногидрата (Sigma, США) в дозе 150 мг/кг в 0,4 мл цитратном буфере, однократно. Показатели углеводного обмена изучались до (исходный показатель) и на 7, 14 и 21-е сутки (опытные показатели) патологии. При взятии крови из хвостовой вены создавалась гиперемия, помещением хвоста крысы в воду с температурой 40–50 ℃ на несколько мин. Далее в хвостовую вену вводилась игла размером G-24, и кровь собиралась в пробирки с гепарином. Плазма выделялась центрифугированием крови в центрифуге EBA 200 (компания Hettich) в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин. В плазме крови содержание глюкозы определялось с помощью реагентов Human (Германия) на автоматическом анализаторе Humastar 100, а содержание инсулина и С-пептида с помощью реагентов Rat Insulin, ELISA Kit и Rat C-Peptide ELISA Kit (США) на иммуноферментном анализаторе Mindray MR 96A (Китай). На основании полученных результатов оценивалась инсулинорезистентность – HOMA-IR, Caro, QUICKI, TGI и функциональная активность β-клеток (HOMA2-В%) [6]. На 21-е сутки у все крыс проводился глюкозотолерантный тест (ГТТ): у животных, оставленных на ночь без корма, утром бралась кровь, через зонд вводился 20 % раствор глюкозы в дозе 2 г/кг веса. Содержание глюкозы в крови определялось с помощью глюкометра (Contour TS, Bayer) на 30, 60, 90 и 120 мин. На 24-е сутки у этих крыс проводился инсулинотолерантный тест (ИТТ): у животных, оставленных на ночь без корма, утром бралась кровь, далее подкожно вводился инсулин НовоРапид Пенфил (Novo Nordisk A/S, Дания) в дозе 0,75 ЕД/кг. Содержание глюкозы в крови определялось с помощью глюкометра (Contour TS, Bayer) на 15, 30, 60, 90 и 120 мин. Площадь под кривой «концентрация глюкозы – время» в обоих тестах (AUC) рассчитывалась линейно-логарифмическим трапециевидным методом (https://www.certara.com/knowledge-base/calculating-auc-linear-and-log-linear/). Коэффициент скорости утилизации глюкозы рассчитывали на основе ИТТ (КИТТ). Для расчета использовали формулу: К = 0,693·100/t½, где 0,693 – ln2, величина, отражающая экспоненциальный распад, t½ – период полувыведения глюкозы, рассчитанный из графика линейной регрессии и 100 – коэффициент перевода на проценты. КИТТ выражали в % глюкозы/мин. Количественные характеристики выборок описывались посредством средней (М), медианы (Ме), интерквартильного размаха (LQ 25 %; UQ 75 %). При сравнении двух независимых выборок использовали критерий Манна – Уитни. Критический уровень статистической значимости принят р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Для проведения исследований, учитывая различия животных по активности метаболизирующей функции печени, общая популяция крыс была разделена на быстрых, средних и медленных метаболизаторов с помощью теста наркотического сна. Из 120 животных была отбракована 1 крыса, так как она резко отличалась от остальных по длительности наркотического сна (спала всего 3 мин). Статистические показатели общей популяции и разных фенотипов крыс по метаболизирующей функции печени приведены в табл. 1. В выбранной выборке 77 крыс (64,7 %) оказались средними метаболизаторами.

Через месяц после разделения крыс на фенотипы, из группы средних метаболизаторов случайным образом были отобраны 12 крыс для контрольной и 12 крыс для опытной группы. Крысам опытной группы в течение трех дней перорально вводился бензонал в крахмальном клейстере в дозе 50 мг/кг веса. На 4-й день для оценки степени индукции МОС печени у крыс обеих групп проводился тест наркотического сна (табл. 2).

Таблица 1

Статистические показатели общей популяции и разных фенотипов крыс по метаболизирующей функции печени (M в мин)

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Н. д. – недостоверно.

Таблица 2

Результаты наркотического сна крыс со средней скоростью метаболизма ксенобиотиков и на фоне введения бензонала

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Таблица 3

Показатели метаболизма углеводов в процессе развития аллоксанового диабета у крыс при предварительном введении бензонала

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

* – Р < 0,05 по сравнению с показателем контрольной группы.

Видно, что у крыс при введении бензонала длительность наркотического сна уменьшилась на 42,1 % (P1–2 < 0,001). На следующий день у крыс брали кровь (для определения исходного уровня показателей углеводного обмена). Затем моделировался СД однократным внутрибрюшинным введением аллоксана моногидрата (Sigma, США) в дозе 150 мг/кг массы тела в 0,4 мл цитратного буфера. Показатели углеводного обмена у экспериментальных животных изучались на 7, 14 и 21-е сутки развития экспериментального СД. К 7-м суткам в контрольной группе пали 2 крысы, а к 14-м – еще 1. Следовательно, из 12 крыс пали 3, смертность составила 25 %. У группы крыс, предварительно получавших бензонал, из 12 крыс до 7-х суток пали 2 крысы, смертность составила 16,7 %. Результаты изучения показателей углеводного обмена при экспериментальном СД на фоне предварительного введения бензонала приведены в табл. 3.

Из нее видно, что на 7, 14 и 21-е сутки аллоксанового СД содержание глюкозы в крови крыс оказалось повышенным по сравнению с исходным показателем на 122,1; 127,3 и 178,9 % соответственно. При этом содержание инсулина в крови крыс оказалось сниженным на 44,1; 51,3 и 62,5 % соответственно на 7, 14 и 21-е сутки аллоксанового СД. Наконец, содержание С-пептида в крови крыс на 7, 14 и 21-е сутки аллоксанового СД оказалось сниженным на 9,7; 23,0 и 36,2 % соответственно. При этом снижение содержания С-пептида на 9,7 % на 7-е сутки оказалось статистически незначимым (Р > 0,05).

У крыс с предварительным введением бензонала на 7, 14 и 21-е сутки аллоксанового СД содержание глюкозы в крови оказалось повышенным по сравнению с исходным показателем на 195,7; 81,5 и 53,1 % соответственно. При этом повышенное содержание глюкозы в крови крыс с бензоналом на 22,2 % по сравнению с контрольной группой оказалось статистически незначимым (Uэмп = 27, для p ≤ 0,01 Uкр = 19 и p ≤ 0,05 Uкр = 27), в то же время его снижение на 26,7 (Uэмп = 2, для p ≤ 0,01 Uкр = 16 и p ≤ 0,05 Uкр = 24) и 49,6 % (Uэмп = 0, для p ≤ 0,01 Uкр = 16 и p ≤ 0,05 Uкр = 24) на 14-е и 21-е сутки оказалось статистически значимым.

В содержании инсулина в крови у крыс с предварительным введением бензонала наблюдалось снижение на 38,2; 41,3 и 51,4 % по сравнению с исходным значением, соответственно срокам исследования. При этом значения инсулина статистически значимо не отличались от значений в контрольных группах (Uэмп = 41 и Uэмп = 30 на 14-е и 21-е сутки соответственно). В содержании С-пептида в крови у крыс с предварительным введением бензонала также наблюдалось снижение, однако, в отличие от содержания инсулина, снижение его на 7,9 и 11,5 % по сравнению с исходным показателем на 7-е и 14-е сутки патологии оказалось статистически незначимым. Статистически значимое снижение его уровня на 27,8 % наблюдалось на 21-е сутки экспериментального СД. При этом значения С-пептида статистически значимо не отличались от значений в контрольных группах (Uэмп = 41 и Uэмп = 36 на 14-е и 21-е сутки соответственно).

Изучение индексов инсулинорезистентности показало, что у крыс контрольной группы HOMA-IR оказался повышенным от исходного значения на 25 % только на 7-е сутки патологии, на 14-е и 21-е сутки он не отличался статистически значимо от исходного значения (табл. 4). Вместе с тем индекс Caro оказался резко повышенным от исходного значения: на 291,4; 353,8 и 633,4 % соответственно на 7, 14 и 21-е сутки патологии. Индекс QUICKI изменился не сильно: наблюдалось его статистически значимое снижение только на 7-е сутки всего на 3,4 %. Неинсулиновый показатель TGI, аналогично индекса Caro, оказался повышенным от исходного значения: на 15,7; 17,4 и 20,7 % соответственно на 7, 14 и 21-е сутки патологии.

При предварительном введении бензонала индекс HOMA-IR оказался повышенным от исходного значения на 81,2 % на 7-е сутки, на 14-е сутки статистически значимого отличия от исходного значения не наблюдалось, и на 21-е сутки он оказался ниже исходного значения на 25,9 %. При этом по сравнению с контрольным значением он оказался выше на 23,2 % на 7-е сутки и ниже его на 40,6 % на 21-е сутки.

Таблица 4

Индексы инсулинорезистентности в процессе развития аллоксанового диабета у крыс и при предварительном введении бензонала

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

a – P < 0,05 по сравнению с исходным показателем; b – P < 0,05 по сравнению с показателями, 7-е сутки; c – P < 0,05 по сравнению с показателями, 14-е сутки.

Индекс Caro оказался повышенным от исходного значения на 407,1; 231,2 и 222,5 % соответственно на 7, 14 и 21-е сутки патологии. По сравнению с контрольным значением его повышение на 31,2 % оказалось статистически незначимым (Р > 0,05). На 7-е сутки он оказался ниже на 26,1, а на 21-е сутки на 55,5 % от контрольных значений. Индекс QUICKI изменился не сильно: наблюдалось его статистически значимое снижение только на 7-е сутки всего на 3,4 %. При предварительном введении бензонала данный индекс оказался выше контрольного значения на 10,5 % только на 21-е сутки. Неинсулиновый показатель TGI оказался повышенным от исходного значения на 10,1; 10,0 и 9,8 % соответственно на 7, 14 и 21-е сутки патологии. При введении бензонала он также оказался статистически значимо ниже от значений контрольной группы на 5,0 и 7,7 % на 14-е и 21-е сутки патологии.

Результаты индексов инсулинорезистентности оказались не совсем однозначными. Возможно, это связано с тем, что они в основном разработаны для СД2 у людей. В то же время в научной литературе имеются работы, где применены эти индексы у крыс [7–9] и собак [10]. Неоднозначность результатов заставила нас провести тест прямого определения чувствительности тканей к глюкозе – ГТТ и инсулину – ИТТ. ГТТ, проведенный на 21-е сутки патологии, все же показал значительные нарушения чувствительности к глюкозе при аллоксановом диабете (рис. 1). У крыс с аллоксановым диабетом исходный уровень глюкозы в крови был значительно повышен после ночного голодания и во все интервалы времени после введения глюкозы (рис. 1, а). При экспериментальном СД с предварительным введением бензонала, хотя исходный уровень глюкозы крови был почти вдвое ниже, чем у контроля, однако ее содержание в крови во все интервалы времени после введения глюкозы практически не снижалось. При этом площадь под кривой при проведении ГТТ у крыс с предварительным введением бензонала была в 5,8 раза ниже по сравнению с контрольным значением (рис. 1, б).

По графику ИТТ видно (рис. 2), что концентрация глюкозы в крови крыс контрольной группы (аллоксановый СД) после введения инсулина максимально уменьшалась через 60 мин (до 7,44 ммоль/л), в крови крыс с предварительным введением бензонала – спустя 30 мин (до 2,7 ммоль/л). При этом площадь под кривой «концентрация глюкозы – время» при ИТТ в предварительном введении бензонала оказалась ниже на 31,3 % от значения контрольной группы (рис. 2, б).

Учитывая схожесть изменений кривых до 30 мин, была рассчитана константа скорости утилизации глюкозы на основании ИТТ (КИТТ) (рис. 3). При этом был выбран отрезок в 15 мин, учитывая строгое линейное снижение содержания глюкозы в этот период исследования (рис. 3, а). Показатель КИТТ у интактных животных был равен 2,13 % глюкозы/мин, у животных контрольной группы (аллоксановый СД) он равнялся 1,21 % глюкозы/мин, тогда как при предварительном введении бензонала этот показатель был равен 4,57 % глюкозы/мин (рис. 3, б).

Рис. 1. Тест на толерантность к глюкозе у интактных крыс (серая кривая), крыс с аллоксановым диабетом (оранжевая кривая) и с предварительным введением бензонала (голубая кривая)(а): по оси абсцисс – время после введения глюкозы, мин; ось ординат – концентрация глюкозы в крови, ммоль/л; б – площадь под кривой «концентрация глюкозы – время» (ммоль·мин/л) при глюкозотолерантном тесте у интактных крыс (серый столбик), у крыс с аллоксановым диабетом (оранжевый столбик) и при предварительном введении бензонала (голубой столбик) Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Рис. 2. Тест на толерантность к инсулину у интактных крыс (серая кривая), крыс с аллоксановым диабетом (оранжевая кривая) и с предварительным введением бензонала (голубая кривая) (а): по оси абсцисс – время после введения инсулина, мин; ось ординат – концентрация глюкозы в крови, ммоль/л; б – площадь под кривой «концентрация глюкозы – время» (ммоль·мин/л) при инсулинотолерантном тесте у интактных крыс (серый столбик), у крыс с аллоксановым диабетом (оранжевый столбик) и при предварительном введении бензонала (голубой столбик) Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Рис. 3. Характер кривой при ИТТ в отрезке времени 0–15 мин у интактных (серая кривая), контрольных крыс (оранжевая линия) и крыс с предварительным введением бензонала (голубая кривая)(а): по оси абсцисс – время после подкожного введения инсулина, мин; ось ординат – концентрация глюкозы в крови, ммоль/л; константа скорости утилизации глюкозы на основании ИТТ (КИТТ) у интактных (серый столбик), контрольных крыс (оранжевый столбик) и крыс с предварительным введением бензонала (голубой столбик) (б): в % глюкозы/мин. Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Анализ результатов по изучению скорости утилизации (КИТТ) свидетельствует о развитии инсулинорезистентности у крыс с аллоксановым СД. Это несколько парадоксально, поскольку аллоксановый диабет 1 типа обусловлен дефицитом инсулина, а не резистентностью к нему. В то же время некоторые авторы показали, что аллоксан вызывает инсулинопенический диабет с нарушением толерантности к глюкозе и инсулинорезистентность [10]. Возможно, реакция организма крыс с аллоксановым диабетом на введении инсулина не обусловлена развитием истинной инсулинорезистентности. Это может быть реакцией измененного исходного статуса организма за счет первичного диабета, вызванного аллоксаном.

В литературе имеются данные о негативной роли в усугублении тяжести СД за счет глюкокортикоидных гормонов, которые повышаются при СД1 [11–13]. Известно, что они стимулируют процесс глюконеогенеза в печени и почках. Представляет интерес также довольно резкое повышение значения КИТТ у крыс с предварительным введением бензонала.

Рис. 4. Функциональная активность β-клеток в динамике развития аллоксанового сахарного диабета (столбики) и на фоне предварительного введения бензонала (кривая). По оси ординат – функциональная активность β-клеток в усл. ед., * – Р < 0,05 по сравнению со значениями контрольной группы Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Известно, что бензонал является мощным индуктором МОС печени. Можно предполагать, что на фоне индукции ферментов печени ускоряется метаболизм аллоксана, и это снижает его токсическое действие на β-клетки поджелудочной железы. Однако метаболизм аллоксана прямо не связан с ферментами системы цитохрома Р-450. Аллоксан детоксицируется на II фазе путем конъюгации его токсичных интермедиатов с восстановленным глутатионом при участии ферментов глутатионтрансфераз. В то же время известно, что фенобарбитал индуцирует глутатионтрансферазу [14, 15]. Тогда можно предполагать об усилении выведения аллоксана из организма при индукции его МОС предварительным введением бензонала. Это означает снижение количества токсичных интермедиатов аллоксана и менее существенное повреждение β-клеток поджелудочной железы. Изучение функциональной активности β-клеток показало, что введение аллоксана приводит к резкому ее снижению. Так, на 7, 14 и 21-е сутки она оказалась ниже исходного показателя на 87,2; 89,6 и 93,9 % (рис. 4). При предварительном введении бензонала функциональная активность β-клеток на 7, 14 и 21-е сутки исследования оказалась ниже исходного показателя на 92,7; 86,5 и 84,3 % от исходного значения. При этом сниженное значение этого показателя на 21,7 % от значения контрольной группы на 7-е сутки оказалось статистически незначимым (Р > 0,05), а на 14-е и 21-е сутки оно оказалось выше на 76,1 и 251 % соответственно от значений контрольной группы.

Заключение

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о более благоприятном течении экспериментального аллоксанового диабета у крыс на фоне предварительного введения противоэпилептического препарата бензонала (бензобарбитала). Целью данного исследования была только оценка степени аллоксанового диабета у крыс при предварительном введении бензонала (бензобарбитала), и она не включала раскрытие механизмов положительного влияния его на течение патологии. Противоречивые данные в литературе о влиянии противоэпилептических препаратов на течение СД требуют дальнейших исследований этого вопроса с целью раскрытия механизмов положительного влияния бензонала на течение СД.