Научный журнал
Научное обозрение. Биологические науки
ISSN 2500-3399
ПИ №ФС77-57454

ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ УГЛЕЙ В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Джакашева М.А. 1
1 Министерство Образования и Науки Республики Казахстан «Южно-Казахстанский государственный университет им. М.Ауезова»
Технологически проработан и апробирован сорбционный метод очистки и выделения пектолитического ферментного препарата из культуральной жидкости штамма Aspergillus awamori 56-2-53-85-375, полученного в результате многоступенчатой селекции. Адсорбционная очистка с помощью микропористого активированного угля марки КАД-Г позволяет проводить очистку и выделение пектиназ при минимальном снижении общей активности ферментных растворов. Активный уголь имеет сильно развитую пористую структуру, образованную главным образом мезопорами от 0,8-0,2 мл/г в диаметре. При дозировке сорбента 10 г/л достигается степень очистки по цветности 63%, удельная активность пектиназы увеличивается до 97,5% при потере активности 4,8%. Обесцвечивание пектолитических ферментных растворов и удаление низкомолекулярных неактивных примесей делает возможным его использование на начальном этапе очистки.
пектиназа
Aspergillus awamori
очиска
выделение
активированный уголь
культуральная жидкость
1. Донцов А.Г., Шубаков А.А. Пектинолитические ферменты: очистка, активация, микробиологический синтез. Екатеринбург: Изд-во УрО РАН, 2010. - C. 82-90.
2. Джакашева М.А., Кедельбаев Б.Ш., Есимова А.М. Культивирование штамма Aspergillus awamori 56-2-53-85-375 – продуцента пектиназ // Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева. – 2016. – №2. –С.77-84.
3. Ajayi A.A., Osunlalu E.O., Peter-Albert C.F., Adejuwon A.O. Studies on pectinolytic and proteolytic enzymes from deteriorated grapes (Vitis vinifera) // Covenant Journal of Phsical and Life Sciences. - 2014. - Vol. 1. - № 2. - P. 1-15.
4. Dzhakasheva M.A., KedelbayevB.S. Getting the active strain of Aspergillus awamori – pectinase produser // International journal of applied and fundamental research.- 2014. - № 11(4). - P.593-597.
5. Lowry O.H., Roserbrough N.J., Fan A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem., - 1951. - Vol. 193.- P. 265-275.
6. Sunnotel O., Nigam P. Pectinolytic activity of bacteria isolated from soil and two fungal strains during submerged fermentation // World Journal of microbiology and Biotechnology. - 2002.- №18. - P. 835-839.
7. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. A Wiley-Interscience Publication. John Wiley & Sons. Inc., 1998. - P. 139-141.

Пектиназы – это ферменты, катализирующие реакции расщепления пектиновых веществ, которые имеют большое промышленное значение в плодоперерабатывающей промышленности [6]. Это обусловлено тем, что пектиназа – это не один фермент, а комплекс, состоящий из нескольких пектинрасщепляющих веществ: пектинэстеразы, полигалактуроназы, пектинлиазы и пектатлиазы. Кроме того, промышленные пектиназы не являются чистыми ферментными препаратами и обычно обладают побочной активностью, которая проявляется в том, что пектиназы могут выполнять функции целлюлазы, гемицеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы и протеазы [3,7].

Культуральные жидкости, полученные после ферментации микроорганизмов – продуцентов пектолитических ферментов, содержат значительное количество нерастворимых примесей. Существует множество способов выделения и очистки ферментов из культуральной жидкости и растворов технических ферментных препаратов, сущностью которых является разделение многокомпонентных смесей органических веществ и минеральных солей для удаления основной массы неактивных белков и примесей небелковой природы. Наличие в ферментном препарате примесей углеводов и пектиновых веществ может существенным образом исказить результаты анализа состава продуктов ферментолиза пектиновых полисахаридов и затруднить выделение физиологически активных фрагментов [1]. Поэтому разработка способов получения очищенных и активных пектолитических ферментов является весьма актуальной.

Материалы и методы исследований

Культура мицелиального гриба A. awamori 56-2-53-85-375 получена в результате многоступенчатой селекции и мутагенеза на кафедре биотехнологии Южно-Казахстанского государственного университета им. М. Ауэзова, она поддерживается на скошенном сусло-агаре при 4оС [4].

Активность пектолитического комплекса ферментов определяли по методике действующего ГОСТ Р 55298-2012. Мицелий, полученный в процессе культивирования A. awamori 56-2-53-85-375, отделяли от культуральной жидкости на фильтре и затем подвергали водной экстракции.

Потери активности ферментных растворов рассчитывали по отношению разности между исходной и конечной активностью пектиназы к исходной ее величине и выражали в процентах. Содержание белка определяли по методу Лоури [5].

Пектиназы выделяли и очищали из культуральной жидкости, полученной после культивирования штамма A. awamori 56-2-53-85-375 в конусообразных колбах Эрленмейера объемом 250 мл на термостатированной качалке (220 об/мин) при температуре 30o C с pH 3,2 в течение 84 ч на жидкой питательной среде следующего состава, масс. %: свекловичный жом : виноградные выжимки : хлопковые створки (1:1:1) - 3, лактоза – 0,125, солодовые ростки : экстракт из мицелия (1:1) – 1%, (NH4)2SO4 – 0,5, KH2PO4 – 0,2, MgSO4–0,1[2].

Активированные угли для очистки культуральной жидкости предварительно размалывали и фракционировали путем просеивания на ситах до получения гранул от 100 до 280 мкм. К культуральной жидкости объемом 1000 мл при 4оС добавляли микропористые угли, смесь тщательно перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин, после чего сорбент отделяли фильтрованием под вакуумом водокольцевого вакуумного насоса «Dolphin LC 0030 A» («Busch», Германия). В фильтрате проверяли содержание белка и пектиназную активность. Оценку содержания пектиновых веществ в культуральных жидкостях осуществляли по цветности растворов путем измерения оптической плотности на фотоколориметре КФК-2 при длине волны 315 нм. Степень очистки по цветности оценивали как отношение разности между исходной и конечной активностью пектиназы к исходной ее величине и выражали в процентах.

Оценку результатов и их статистической достоверности осуществляли с использованием прикладных программ «MathCAD» и «Statistica».

Таблица

Влияние условий обработки культуральной жидкости активированными углями

Марка угля

Условия обработки

Значение

Удельная активность, ед/мг белка

Степень очистки по цветности,%

Потери активности ПкС, %

СКТ

рН культуральной жидкости

3,0

77,0

63

0,5

3,5

81,0

65

1,5

4,0

80,8

64

2,8

4,5

76,0

57

3,0

5,0

71,3

50

4,5

5,5

63,4

44

6,3

Дозировка сорбента, г/л

5

65,0

48

4,0

10

82,0

54

6,5

15

81,4

61

22,0

20

78,0

66

28,0

БАУ-Б

рН культуральной жидкости

3,0

91,2

70

1,0

3,5

95,0

71

2,5

4,0

91,8

68

4,4

4,5

85,0

64

6,8

5,0

77,0

52

9,0

5,5

63,0

44

14,3

Дозировка сорбента, г/л

5

73,0

50

20,0

10

89,4

54

25,0

15

85,5

59

37,0

20

79,0

67

42,0

КАД-Г

рН культуральной жидкости

3,0

90,1

75

0,3

3,5

94,0

75

0,8

4,0

90,8

73

1,5

4,5

88,0

70

1,8

5,0

85,3

60

3,0

5,5

81,0

50

5,6

Дозировка сорбента, г/л

5

83,0

54

2

10

97,5

63

4,8

15

91,4

70

18

20

95,0

77

25

 

Результаты и обсуждение

Для удаления из культуральной жидкости A. awamori 56-2-53-85-375 низкомолекулярных примесей, таких как пектиновые вещества, использовали активированные микропористые угли марок СКТ, БАУ-Б и КАД-Г с размерами гранул от 100 до 280 мкм, который предварительно размалывали и фракционировали путем просеивания на ситах. Активированные угли представляют собой пористый углеродный адсорбент с развитой внутренней поверхностью, состоящей из открытых пор и капиллярных каналов объемом 0,23-0,26 мл/г. В таблице показаны зависимость степени очистки по цветности от значений рН среды при обработке культуральной жидкости, полученной после культивирования мицелиального гриба A. awamori 56-2-53-85-375 активированными углями марок СКТ, БАУ-Б и КАД-Г и их дозировок.

Из полученных данных видно, что в диапазоне рН среды 3,0-3,5 для всех выбранных марок активированных микропористых углей достигается наибольшая эффективность очистки ферментных растворов. Из данных таблицы 1 видно, что при оптимальном значении рН среды влияние дозировки сорбентов в культуральной жидкости на эффективность очистки является прямопропорциональным. Высокая эффективность при обесцвечивании и очистке растворов наблюдается при использовании угля марки КАД-Г с дозировкой 10 г/л.

Уголь активированный КАД-Г обычно применяют для очистки от органических загрязнений сточных вод при производстве гальванических покрытий, а также для очистки оборотных и технологических вод. Его основные характеристики: размер зерен, мм - 1,0-2,8, насыпная плотность, г/дм3 - < 460, прочность, % - >70, объем пор суммарный, см3/г - >0,7, объем микропор, см3/г - 0,23-0,26, адсорбционная способность, % - 60-62. Массовая доля золы, % - 10-12.

Заключение

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что применение микропористого угля марки КАД-Г для обесцвечивания ферментных растворов и очистки культуральной жидкости от пектиновых веществ на первом этапе является эффективным. При дозировке сорбента 10 г/л достигается степень очистки по цветности 63%, удельная активность пектиназы увеличивается до 97,5% при потере активности 4,8%.


Библиографическая ссылка

Джакашева М.А. ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ УГЛЕЙ В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ // Научное обозрение. Биологические науки. – 2016. – № 6. – С. 20-22;
URL: https://science-biology.ru/ru/article/view?id=1018 (дата обращения: 09.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074