science-review.ru
Введение
Гельминты амфибий занимают особое место в структурном уровне видового разнообразия водных биоценозов. Паразитизм является одним из важных биотических факторов, определяющих численность видов-хозяев, и, регулируя численность хозяев, оказывает большое влияние на структуру и деятельность всей экосистемы [1, с. 98–106].
Род Mesocestoides включает множество неизученных паразитов с уникальными характеристиками во многих аспектах их биологии. В настоящее время проводится множество исследований по изучению гельминтофауны земноводных. Виды рода Mesocestoides широко распространены по всему миру, зарегистрировано три вида цестод, принадлежащих к этому роду. На этапах развития представителям этого рода требуется два промежуточных хозяина. Орибатидные клещи и копрофаги заражаются при поедании яиц. Они очень важны как первые промежуточные хозяева онкосферной (6-петлевой личинки) и финной (цистицеркоидной) стадий развития гельминта. Вторыми промежуточными хозяевами, питающимися зараженными членистоногими, являются амфибии, рептилии, птицы (Galliformes, Passeriformes) и млекопитающие (Rodentia) [2; 3]. На этой стадии они превращаются из цистицеркоидов в личинки тетратиридий. Личинки тетратиридий созревают в тонком кишечнике хозяина. Позже яйца гельминта вместе с испражнениями и проглотидами хозяина выделяются во внешнюю среду.
M. lineatus (Goeze, 1782) паразитирует у птиц и млекопитающих во взрослых формах, вызывая мезоцестоидоз. Иногда человек также может заразиться видами рода Mesocestoides, второй промежуточный вариант; заражение происходит при употреблении в пищу недоваренных или сырых органов хозяина (например, сырой печени змеи или куриных потрохов). Зараженные собаки и кошки не представляют прямого зоонозного риска для человека [4, с. 1455–1484].
Видами рода Mesocestoides, поражающими человека, являются M. litteratus, M. lineatus (Goeze, 1782) и M. variabilis (Muеller, 1928). Передача инвазии от человека зарегистрирована в странах Восточной Азии, включая Японию, Китай, Корею и США. M. variabilis является распространенным видом в Северной Америке, тогда как M. litteratus и M. lineatus более распространены в странах Европы и Азии [5, с. 566–567].
При идентификации видов этого рода достоверность определяется по морфологическим признакам их взрослых особей, но на личиночных стадиях развития трудно их идентифицировать по морфологическим признакам. При определении личиночных стадий вида используют молекулярно-генетические методы на основе нуклеотидной последовательности их митохондриального гена цитохрома оксидазы 1 (Сох-1), рибосомальных генов 18S, 12S, 28S и ITS-2 [6, с. 246–253].
Впервые в Узбекистане личинки M. lineatus (Goeze, 1782) были обнаружены у лягушки B. viridis, а позднее у B. turanensis и B. pewzowi [2; 7; 8]. Однако во всех этих исследованиях на основании морфологического анализа был выделен вид M. lineatus (Goeze, 1782).
Цель настоящей работы – морфологическая, эпизоотологическая и молекулярно-генетическая классификация личинок M. lineatus (Goeze, 1782), относящихся к роду Mesocestoides.
Материалы и методы исследования
Морфологический анализ
Для проведения исследований в Сурхандарьинской и Кашкадарьинской областях весной и летом 2024 г. собрано 17 экземпляров жаб B. turanensis (Hemmer, Schmidtler & Bohme, 1978) и 11 экземпляров лягушек P. terentievi (Межжерин, 1992). При этом задние лапки собранных амфибий были пронумерованы с помощью специальной бирки. Для проведения гельминтологических исследований амфибии внутрибрюшинно вводили 20 % бензокаин гидрохлорид, используя руководство AVMA (AVMA Guidelines for the Euthanasia, 2020) по эвтаназии.
Гельминтологический материал собирали от земноводных методом полного гельминтологического вскрытия (Скрябин, 1928) и фиксировали 70 % этанолом. Для морфологической идентификации видов в лабораторных условиях приготовлено более 20 постоянных и временных препаратов. При морфологическом уточнении видов сравнивали с данными зарубежных и местных иследователей [2; 3; 9]. Получение оригинальных фотографий видов в приготовленном препарате осуществляли с помощью микроскопов ML-2000-(Meiji Techno CO., LTD, Япония), NSZ-818 (Nexscope, Китай), имеющихся в лаборатории молекулярной зоологии Института зоологии АН РУз. Идентификация видов гельминтов проводилась с использованием веб-сайта Global Biodiversity Information Facility (https://www.gbif.org/).
Эпизоотологический анализ
Для проведения данных исследований было собрано из Кашкадарьинской области 8 особей P. terentievi и 6 особей B. turanensis, а из Сурхандарьинской области – 3 особи P. terentievi и 11 особей B. turanensis.
Для характеристики зараженности гельминтами земноводных Сурхандарьинской и Кашкадарьинской областей использованы следующие паразитологические показатели:
Экстенсивность инвазии (ЭИ):
где Nинф – количество инфицированных хостов;
Nпровер – количество проверенных владельцев.
Интенсивность инвазии (ИИ):
где Nгельминтов – количество обнаруженных гельминтов;
Nзараженных – количество хозяев, зараженных данным гельминтом.
Индекс доминирования (ИД):
где Nгельминтов – количество обнаруженных гельминтов;
Nпровер – количество проверенных владельцев.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения Statistics Excel 2003 и BioStat.
Молекулярно-генетический анализ
Для выделения геномной ДНК из M. lineatus (Goeze, 1782) использовался набор реагентов GeneJET Genomic DNA Purification Column. Концентрацию каждой ДНК определяли с помощью спектрофотометра Thermo Fisher Scientific (Китай). Экстрагированный образец геномной ДНК хранили при -20 °С до использования для ДНК-полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Процедура ПЦР
При проведении ПЦР использовались праймеры для считывания нуклеотидов, принадлежащих участку ITS1+5.8S+ITS2 рибосомальной ДНК (рДНК), который широко используется при молекулярно-генетической идентификации цестод.
Состав реакционной смеси: вода – 16,1 мкл, 10-кратный ПЦР-буфер – 2 мкл, dNTP – 0,4 мкл.
Праймеры:
Прямой праймер TW81:
2 мкл (5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’).
Обратный праймер AB28:
2 мкл (5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’).
Общий объем смеси: 20 мкл.
Условия ПЦР:
1. 94°С – 3 мин (инициация).
2. 94°С – 45 с (денатурация).
3. 72°С – 10 мин (аннелирование и элонгация).
4. Заключительный этап: 72°С – 5 мин [10, с. 10–18].
Наличие ДНК в продуктах ПЦР определяли методом электрофореза на 2,0 % агарозном геле при 100 V. После окончания электрофореза гель просматривали под лучами ультрафиолетового трансиллюминатора, делали снимок и записывали результаты.
Экстракция и секвенирование ДНК
Для амплификации и экстракции ДНК из геля использовали набор реагентов производства ООО «Silex M» (Москва, Россия). Секвенирование ДНК проводили с использованием набора реагентов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1, а продукты реакции секвенировали в GATC Biotech AG.
Анализ полученной нуклеотидной последовательности проводили с использованием следующих программи: Bioedit, Clustal W2, DNAstar™ и PAUP 4.0b10.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты морфологического исследования
При рассмотрении под микроскопом временных препаратов личинки тетратирид Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782) было установлено, что личинки имеют преимущественно эллипсовидную форму, а иногда округлую. Длина составляет 0,52–1,37 мм (в среднем 1,17±0,2 мм, n = 28), ширина – 0,4–0,9 мм (в среднем 0,56±0,17 мм, n = 28). На поверхности тела наблюдается множество поперечных складок. На переднем конце тела имеется воронкообразная перетяжка, образованная сколексом. Тело личинок тетратиридий цельное и не разделено на членики. Удлиненный задний конец тела сужен, на нем видна осморегуляторная система, то есть разделительные поры.
Личинки тетратиридий имеют выпяченный сколекс с четырьмя присосками и часто окружены тонкой стенкой кисты. Эти присоски служат для прочного прикрепления к стенке кишечника вторичных промежуточных хозяев (рис. 1).
Рис. 1. Общий вид личинки тетратиридий Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782), larvae
Результаты эпизоотологического исследования
По результатам проведенных гельминтологических исследований из 11 обследованных лягушек P. terentievi 4 были заражены личинками Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782).
Зараженность земноводных Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782), larvae тетратиридиями
|
№ |
Области |
Виды амфибий |
Итого |
|||||||
|
P. terentievi |
B. turanensis |
|||||||||
|
Количество обследованных |
Из них заражены, (ЭИ) % |
(ИИ) (экз.) |
Количество обследованных |
Из них заражены, (ЭИ) % |
(ИИ) (экз.) |
Количество обследованных |
Из них заражены, (ЭИ) % |
(ИИ) (экз.) |
||
|
1 |
Кашкадарьинская |
8 |
3, (37,5) |
1–4 |
6 |
2, (33,3) |
1–3 |
14 |
5, (35,7) |
1–4 |
|
2 |
Сурхандарьинская |
3 |
1, (33,3) |
3 |
11 |
6, (54,5) |
1–5 |
14 |
7, (50) |
1–5 |
|
Общий |
11 |
4, (36,36) |
1–4 |
17 |
8, (47) |
1–5 |
28 |
12, (42,85) |
1–5 |
|
Экстенсивность инвазии составила 36,36 %, интенсивность инвазии – 1–4 экз. Из 17 жаб B. turanensis 8 были заражены личинками Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782). Экстенсивность инвазии составила 47 %, а интенсивность инвазии – 1–5 экз. (таблица).
По данным таблицы, в 5 из 14 (35,7 %) обследованных амфибий в Кашкадарьинской области и в 7 из 14 (50 %) в Сурхандарьинской области, а также в 12 из 28 (42,85 %) от общего числа обследованных земноводных обнаружены личинки тетратиридий. Зараженные земноводные указывают на серьезный риск для диких животных и людей в этих областях.
Результаты молекулярно-генетической идентификации
В последние годы результаты молекулярно-генетических исследований, основанных на изучении нуклеотидов области ITS1+5.8S+ITS2 рибосомальной ДНК (рДНК), позволяют идентифицировать виды. Эти методы широко используются для точной идентификации цестод и решения нерешенных таксономических задач в сочетании с морфологическими и молекулярно-генетическими подходами, а также при определении спорных видов и фенотипических изменений.
По результатам проведенных молекулярно-генетических исследований была выделена нуклеотидная последовательность длиной 264 пары оснований, принадлежащая ITS-2-региону рДНК вида M. lineatus (Goeze, 1782). Кроме того, для сравнения этих видов были использованы данные о M. litteratus (номер доступа: MH 936660), также принадлежащем к этому роду, из базы данных NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Рис. 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей области ITS-2 рДНК видов, принадлежащих к роду Mesocestoides Vaillant, 1863 на основе материала секвенирования
Как видно из рис. 2, между нуклеотидами выборки M. lineatus_Uzb, принадлежащей к роду Mesocestoides Vaillant, 1863, собранной из южных районов Республики Узбекистан, и выборки M. litteratus, полученной из базы данных NCBI, имеется разница в 7 нуклеотидов. Эти различия заключаются в А-аденине в образце M. lineatus_Uzb по 81-му нуклеотиду, G-гуанине в образце M. litteratus в образце из базы данных NCBI, С-цитозин в 105-м, 140-м нуклеотиде в образце M. lineatus_Uzb, Т-тимин в образце M. litteratus в образце из базы данных NCBI, G-гуанин в образце M. lineatus_Uzb по 164-му нуклеотиду, А-аденин в образце M. litteratus в образце из базы данных NCBI, Т-тимин у видов M. lineatus_Uzb по 230-му нуклеотиду, С-цитозин у видов M. litteratus, полученный из базы данных NCBI, С-цитозин у видов M. lineatus_Uzb по 251-му нуклеотиду, А-аденин у видов M. litteratus, полученный из базы данных NCBI, по 254-му нуклеотиду у типа M. lineatus_Uzb был заменен А-аденин, а у типа M. litteratus заменены Т-тиминовые нуклеотиды, полученные из базы данных NCBI, причем разница между нуклеотидами в участке ITS-2 рДНК составила 2,6 %.
В связи с высокой изменчивостью представителей рода Mesocestoides даже у взрослых особей определение видового состава по морфологическим признакам является затруднительным. Все предыдущие исследования основывались на морфологическом описании личинок M. lineatus (Goeze, 1782) в Узбекистане.
Насколько авторам данной статьи известно, это первое молекулярно-генетическое описание личиночной стадии M. lineatus (Goeze, 1782) у амфибий Узбекистана. Соответственно, гельминты, обнаруженные у ранее упомянутых видов P. terentievi (Межжерин, 1992) и B. turanensis (Hemmer, Schmidtler & Böhme, 1978), были диагностированы как личиночная стадия M. lineatus (Goeze, 1782).
Заключение
До сих пор личиночную стадию M. lineatus (Goeze, 1782) часто идентифицировали в Узбекистане по морфологическим особенностям. Изучение морфологии этого вида показало, что форма преимущественно эллипсовидная, иногда округлая. Длина варьирует от 0,52 до 1,37 мм (в среднем 1,17±0,2 мм, n = 28), ширина – от 0,4 до 0,9 мм (в среднем 0,56±0,17 мм, n = 28). Эпизоотологический анализ показал, что из 28 исследованных земноводных 12 (42,85 %) были заражены паразитами. Анализ регионального распределения образцов показал, что наибольшая экстенсивность инвазии наблюдается в Сурхандарьинской области (50 %). Данная работа представляет первое молекулярно-генетическое описание личиночной стадии M. lineatus (Goeze, 1782), обнаруженной у P. terentievi (Межжерин, 1992) и B. turanensis (Hemmer, Schmidtler & Böhme, 1978). Различие в нуклеотидной последовательности участка ITS-2 рДНК между образцом M. lineatus_Uzb и данными из NCBI (M. lineatus) составило 2,6 %. Нуклеотидная последовательность M. lineatus_Uzb загружена в базу данных NCBI и получила номер доступа PQ 326864.
Молекулярно-генетический и филогенетический анализ показал, что личиночная стадия M. lineatus (Goeze, 1782) лишь незначительно отличается от популяций этого вида из других регионов. Настоящее исследование демонстрирует преимущество метода ПЦР-секвенирования для определения видового состава гельминтов независимо от стадии их развития.
Результаты настоящего исследования способствуют более глубокому пониманию видового состава и филогенетических взаимоотношений представителей рода Mesocestoides в промежуточных и основных хозяевах в разных географических регионах, а также для будущих молекулярно-генетических и морфологических исследований.
Библиографическая ссылка
Алиев Ш.Т., Амиров О.О. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ MESOCESTOIDES LINEATUS (GOEZE, 1782), LARVAE (CESTODA: CYCLOPHYLLIDEA) В УЗБЕКИСТАНЕ // Научное обозрение. Биологические науки. 2025. № 1. С. 22-26;URL: https://science-biology.ru/ru/article/view?id=1392 (дата обращения: 29.04.2025).
DOI: https://doi.org/10.17513/srbs.1392