Scientific journal

Scientific Review. Biological science

ISSN 2500-3399

ПИ №ФС77-57454

Введение

В аутоиммунной природе сахарного диабета 1-го типа (СД1) цитокины играют важную роль в поддержании иммунных реакций, дисбаланс которых могут вызывать нарушения β-клеток островков Лангерганса. Известно, что провоспалительные цитокины участвуют в процессах восстановления, активации и пролиферации β-клеток, поддерживают жизнеспособность клеток поджелудочной железы. Фактор некроза опухоли TNFα (tumor necrosis factor) участвует в воспалительных реакциях на системном и локальном уровнях, играет ключевую роль в патогенезе системных заболеваний [1].

Кроме того, TNFα при нормальных количествах поддерживает такие гомеостатические функции клеток, как клеточная пролиферация и апоптоз, запускает липидные медиаторы эпителия сосудов, тем самым вызывает инфильтрацию иммунных клеток с помощью адгезии лейкоцитов. Повышение уровня в плазме TNFα, опосредуя клетками иммунной системы, играет фундаментальную роль в разрушении клеток поджелудочной железы, что может являться фактором риска в патогенезе сахарного диабета, нарушения липидного обмена, что может быть причиной ожирения и возникновения воспалительных процессов.

Актуально исследование связи полиморфизма генов, аллелей и генотипов SNV, которые могут влиять на их функциональное состояние, влияющие на экспрессию белковых молекул при различных патологических состояниях. Исследования полиморфизма генов сахарного диабета 1 и 2 типа показывают предрасположенность в генотипе статистических данных, исследования полиморфизмов TNFα2308 AA и TNFα2308 A у египетских пациентов выявили взаимосвязи с СД1. Также изучены полиморфизмы -308 G/A TNFα в иранских и саудовских популяциях [2, 3].

Проведенные исследования показывают высокий уровень циркулирующего TNFα –в три-четыре раза выше у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, также в прогрессировании диабетической нефропатии имел место полиморфизм аллель C TNFα – 10 31 T/C. У больных диабетической стопой с генотипом СС по сравнению с больными с генотипом ТТ выявлено повышение уровня TNFα в сыворотке крови [4].

Изучение молекулярно-генетических особенностей функциональной области последовательностей промотора гена TNF-a G-308A в иорданской популяции показало влияние функциональной области на уровень сахара в крови у больных с сахарным диабетом 2-го типа. У лиц с генотипом -308GG с высоким уровнем TNFα, больных сахарным диабетом 2-го типа, выявлены изменение концентрации сахара в крови и резистентность к инсулину [5].

Целью настоящего исследования является изучение взаимосвязи полиморфизма гена TNF-A -308G/A с активностью цитокина TNFα у больных СД 1-го типа, проживающих в Самаркандской области.

Материалы и методы исследования

Настоящее исследование основывается на результатах наблюдения за пациентами с сахарным диабетом 1-го типа, проведенного в отделении диагностики Самаркандского областного центра эндокринологии. Контроль и непосредственную консультативную, научную и методическую помощь оказывал заведующий отделением А.Э. Кадыров.

В исследование были включены пациенты, подписавшие добровольное информированное согласие на участие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Были включены 64 пациента с сахарным диабетом 1-го типа, из них 41 женщина – 70 % и 23 мужчины – 30 %. В группу исследования были включены пациенты, зарегистрированные в эндокринологическом центре, в возрасте от 7 до 40 лет. Контрольную группу составили 198 относительно здоровых лиц, не имеющих в анамнезе СД 1-го типа.

Выделение ДНК

Для выделения ДНК был использован метод лизиса клеток крови путем двойного центрифугирования объема цельной крови в буфере RCLB (Redcellslysisbuffer – эритроцитарный лизирующий буфер) при скорости 1500 об/мин.

Проведение метода полиморфизма длины рестрикционных фрагментов – ПДРФ

Для амплификации полиморфного участка гена TNF-A -308G/A исследованной популяции использовали метод полимеразной цепной реакции с аллельспецифичными праймерами TNF-A-308G/A:

forward 5’-GACAAGCCTGTAGCCCATGT-3’,

reverse 5’- GGAGGTTGACCTTGGTCTGG -3’.

Концентрацию цитокина определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов ЗАО «Вектор Бест» в диапазоне концентраций для TNF-α пг/мл.

Полученные данные обрабатывали с помощью программного пакета GraphPadPrism 10, включая использование встроенных функций статистической обработки.

Результаты исследования и их обсуждение

Ген TNFα кодирует многофункциональный белок, который принимает участие в провоспалительных процессах. В основном секретируется макрофагами, функционирует через рецепторы TNFRSF1A/TNFR1 и TNFRSF1B/TNFBR. TNFα участвует в процессах регуляции, пролиферации и дифференцировки клеток, апоптоза, в патологиях, связанных с аутоиммунными заболеваниями. Широко изучены несколько вариантов гена, в том числе TNFА: -238G/A -308G/A, которые способствуют повышению или снижению продукции цитокина.

Исследования полиморфизма аллелей и генотипов маркеров гена TNFα -308G/A в группе больных СД 1-го типа по сравнению с контрольной группой показали высокие показатели частоты аллеля А в группе больных с СД 1-го типа по сравнению с группой контроля (табл. 1).

Рис. 1. Сравнительная характеристика частот аллелей и генотипов гена TNF-A -308G/A у больных с СД 1-го типа

Таблица 1

Взаимосвязь аллелей и генотипов гена TNF-A -308G/A у больных с СД 1-го типа

Примечание: χ2– показатель достоверности по Пирсону; RR – относительный риск.

Исследования показателя аллеля G свидетельствуют о низких показателях по сравнению с контрольной группой (рис. 1).

При изучении особенностей распределения генотипа GG выявлена достоверная разница в исследованной группе с СД 1-го типа по сравнению с контролем (табл. 1, рис. 1). Анализ гетерозиготного генотипа GA также свидетельствует о различиях между исследованной группой с СД 1-го типа по сравнению с контрольной группой (рис. 1), различий при анализе гомозиготного генотипа АА не было выявлено.

Таким образом, анализ распределения аллелей и частот распределения гена – 308(G/A) TNF у лиц с СД 1-го типа, проживающих в Самаркандской области, свидетельствует о значительном вкладе в предрасположенность к заболеванию, является существенным фактором прогноза у больных с СД 1-го типа, узбекской популяции, проживающих в г. Самарканде.

При сравнении анализа генотипов полиморфизма TNFα -308G/A с различными возрастными группами пациентов с СД1 (табл. 2) у больных с СД 1-го типа, имеющих генотип GG, статистические значимые разницы имели лица старше 10 лет (p ≤ 0,0001). У лиц с генотипом GG 7–10 и ≥ 15 лет в возрастных подгруппах статистически значимых различий не выявлено. Также среди лиц с генотипом GA подростки старше 10 лет имели статистически значимую разницу (p ≤ 0,0001) по сравнению с другими возрастными подгруппами.

Таблица 2

TNFα -308G/A генотипы у детей возрастных групп

Для изучения особенностей развития СД 1-го типа были исследованы показатели TNF-α у лиц СД 1-го типа. Проведенные исследования свидетельствуют о высоком уровне (TNF-α) у лиц с СД 1-го типа по сравнению с контрольной группой (p < 0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Уровень провоспалительных цитокинов TNFα при СД 1-го типа

У больных с СД 1-го типа концентрация TNF-α в периферической крови составила 56,7±4,8 пг/мл, в контрольной группе – 16,3±1,76 пг/мл.

TNFα участвует в системном воспалении, уровни TNFα в плазме связаны с различными факторами риска диабета [6]. Он играет фундаментальную роль в разрушении бета-клеток, опосредованном иммунными клетками, потому достоверно (р < 0,05) высокое содержание его у больных с СД 1-го типа (56,7±4,8 пг/мл) говорит о преобладании в патогенезе СД 1-го типа иммуноопосредованного деструктивного процесса в бета-клетках [7, 8].

Была проведена сравнительная характеристика уровня показателей активности цитокинов TNFα у пациентов с СД 1-го типа, проживающих в Самаркандской области, с генотипами GG, GA гена TNFα -308G/A в общей популяции. Данные представлены в табл. 3. Отмечается, что уровень показателей активности цитокинов TNFα у пациентов с СД 1-го типа Самаркандской области в зависимости от полиморфизма TNFα -308G/A, с генотипом GG и GA наблюдается увеличение количества TNFα пг/мл (55,3±5,6, 58,1±4,4, 16,3±1,76, р ≤ 0,001) высокие концентрации которых обнаружены у лиц с генотипом GA. Таким образом, гетерозиготный генотип GA вносит значительный вклад в развитие аутоиммунного сахарного диабета 1-го типа.

По представленным в табл. 3 и на рис. 3 данным, лица общей популяции с СД 1-го типа гена TNFα -308G/A с генотипами GG n = 27 имели высокие концентрации TNFα пг/мл по сравнению с контрольной группой.

Анализ половых различий уровня цитокинов TNFα в зависимости от генотипов TNFα -308G/A у женщин представлен в табл. 3 и на рис. 3, где отмечается, что у женщин с генотипами гена TNFα -308G/A GG и GA наблюдалось увеличение количества цитокинов (55,1±5,6, 57,1±4,4, 16,3±1,76, р ≤ 0,001) по сравнению с контрольной группой.

Рис. 3. Уровень TNFα в зависимости от половых различий

Анализ содержания цитокинов TNFα у мужчин с СД 1-го типа Самаркандской области полиморфизма гена TNFα -308G/A у лиц мужского пола (табл. 3) показал, что у лиц с генотипами GG и GA полиморфизма гена TNFα -308G/A отмечаются высокие показатели TNFα по сравнению с контролем (56,3±5,6, 59,1±4,4, 16,3±1,76, р ≤ 0,001).

Исследования факторов начала заболевания в зависимости от генотипа GG, GA гена TNFα -308G/A показывают возраст начало заболевания от 7 лет, но существенно число заболевших СД1 типа увеличивается в популяции от 10 лет. Также анализ половых различий встречаемости заболевания СД 1-го типа показал, что в популяции обследованных СД 1-го типа зарегистрировано начало болезни у лиц женского пола, то есть у девочек 7 лет.

Таблица 3

Уровень показателей активности цитокинов TNFα у женщин и мужчин СД 1-го типа Самаркандской области

Примечание. Достоверность разницы между исследованной группой и контролем (р ≤ 0,001).

Заключение

Анализ показателей взаимосвязи между изученными цитокинами показал увеличение концентрации цитокина при СД 1-го типа. Лица с генотипами GG, GA имели высокие концентрации TNFα, гетерозиготный генотип GA независимо от половых различий имели высокие концентрации данного цитокина. Данная ситуация свидетельствует об изменении концентрации в зависимости от замены аллеля А. Полная замена на гомозиготный АА генотип может свидетельствовать о развитии прогрессирующего аутоиммунного СД 1-го типа. Таким образом, ген TNFα -308G/A с показателями цитокина TNFα свидетельствует о вовлеченности иммунных реакций в патогенез СД 1-го типа. Лица женского пола имеют высокие риски развития аутоиммунного СД 1-го типа.