science-review.ru
Введение
Хитин – природный полисахарид, широко распространенный в животном мире – микроорганизмах, насекомых, ракообразных, моллюсках, а также в грибах. По структуре хитин аналогичен целлюлозе за исключением наличия ацетамидной группы у второго углеродного атома. По аналогии с целлюлозой хитин играет в основном функцию защитного и поддерживающего каркаса организмов, являясь прочным и гибким соединением. Хитин является основным компонентом экзоскелета ракообразных, таких как крабы, креветки, и насекомых. Кроме того, он содержится в клеточных стенках грибов, радуле моллюсков и внутренних раковинах и клювах головоногих моллюсков, таких как осьминоги.
Синтез хитина в природе осуществляется в живых организмах с помощью ферментов хитинсинтаз. Объемы воспроизводства хитина в природе составляют по разным оценкам 1012–1014 т в год, что ставит этот полисахарид по распространенности на второе место после целлюлозы [1, 2].
Хитин является достаточно инертным веществом, которое не растворяется в воде и большинстве растворителей, имеет плотную упорядоченную структуру, высокую молекулярную массу. Хитин обладает низкой токсичностью и инертен в желудочно-кишечном тракте млекопитающих. Из-за своих физико-химических свойств хитин в нативном состоянии используется очень ограниченно, например в виде хлопьев или мелкоизмельченного порошка [3]. Хитин широко используется для иммобилизации ферментов, целых клеток, например, в пищевой промышленности для осветления фруктовых соков, переработки молока [4]. Хитин также используется для очистки промышленных сточных вод [5], в качестве вспомогательного вещества и носителя лекарств в виде пленок, гелей или порошков для приложений, связанных с мукоадгезивностью, хитиновые пленки и волокна получили применение в медицине и фармацевтике в качестве материала для перевязки ран и контролируемого высвобождения лекарств [6].
Наиболее широкие возможности раскрываются при модификации хитина в различные производные: хитозан, водорастворимые низкомолекулярные хитин, хитозан и их олигомеры, мономеры N-ацетилглюкозмин и соли D(+)-глюкозамина.
Разработаны различные способы получения производных хитина, которые включают химические, физические и ферментативные.
Наиболее широко используются химические методы гидролиза гликозидной и ацетамидной связей в молекуле хитина под действием кислот и щелочей, приводящие к деполимеризации молекулы хитина и деацетилированию его мономерных ацетилглюкозаминных звеньев.
Получение хитозана заключается в термохимическом деацетилировании хитина. Эта реакция протекает в концентрированных растворах кислот или щелочей. Так как гликозидные связи очень чувствительны к кислой среде и практически не расщепляются в щелочной, деацетилирование избирательно осуществляют в сильнощелочной среде при высокой температуре [7, 8].
Химическая деградация хитина обычно проводится с использованием сильных кислот (HCl, HNO2, HF, H3PO4) или слабых кислот (уксусная кислота, аскорбиновая кислота), но также применяется смесь органических кислот (гидроксиуксусная кислота, молочная кислота и гидратированная лимонная кислота) [9].
Непереработанный хитин не имеет высокой экономической ценности и в больших количествах доступен в качестве побочного продукта пищевой промышленности. Широкое применение находят различные производные хитина, обладающие растворимостью в водных системах и различной биологической активностью. Основные цели биотрансформации хитина – это получение хитозана и низкомолекулярного хитозана, олигосахаридов хитина и хитозана, мономеров – N-ацетилглюкозамина и солей D(+)-глюкозамина.
Хитозан, линейный полимер, состоящий из множества мономеров D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, может быть получен из хитина путем ферментативной или химической обработки до олигомеров с определенной длиной цепи и степенью ацетилирования. Хитозан имеет ряд коммерческих и биомедицинских применений. Он обладает доказанными антибактериальными, противогрибковыми и антиаллергенными свойствами и поэтому представляет интерес для сельскохозяйственной и фармацевтической промышленности. Его можно использовать в качестве средства для обработки семян и биопестицида, чтобы предотвратить грибковые инфекции семян и растений. В фармацевтической промышленности его можно использовать в бинтах и других кровоостанавливающих средствах в качестве антибактериального агента.
Получение хитозана заключается в термохимическом деацетилировании хитина. Эта реакция протекает в концентрированных растворах кислот или щелочей. Так как гликозидные связи очень чувствительны к кислой среде и практически не расщепляются в щелочной, деацетилирование избирательно осуществляют в сильно щелочной среде при высокой температуре [10, 11].
Цель исследования – провести анализ научных сведений по использованию хитинолитических ферментов для модификации и получения олигомеров и мономеров хитина и хитозана.
Материалы и методы исследования
В работе использовался метод систематического литературного обозрения, а также метаанализ литературных данных. По теме исследования было проанализировано 36 научных источников с использованием баз Science Direct, Ingenta и E-library и др. При этом большинство научных работ на иностранном языке и выпущены в последние годы. Авторами статьи проведен анализ количественных данных, оценена достоверность научной литературы, выделены ключевые работы и дана объективная оценка имеющимся результатам.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Классификации хитиназ
Хитиназы (E.C. 3.2.2.14) относятся к гликозилгидролазам, которые гидролизуют хитин до его мономера N-ацетилглюкозамина путем разрыва гликозидных связей. Молекулярная масса хитиназ колеблется в пределах 20–90 кДа. Хитиназы подразделяются на две основные группы: эндохитиназы и экзохитиназы. Эндохитиназы произвольно расщепляют хитин на внутренних участках в случайных местах, образуя низкомолекулярные олигомеры, такие как хитотетриоза, хитотриоза и диацетилохитобиоза, формируя димер диацетилхитобиозы и растворимые низкомолекулярные полимеры GlcNAc. Экзохитиназы были далее разделены на две подкатегории: хитобиозидазы, которые катализируют постепенное высвобождение диацетилхитобиозы, начиная с нередуцирующего конца хитиновой микрофибриллы, и 1-4-β-глюкозаминидазы, расщепляющие олигомерные продукты эндохитиназ и хитобиозидаз, тем самым образуя мономеры GlcNAc [12].
2. Основные источники хитинолитических ферментов
Хитинолитические ферменты, способные расщеплять молекулу хитина до низкомолекулярных соединений вплоть до мономеров в различных организмах, таких как членистоногие, моллюски, нематоды, грибы, растения и прокариоты [13, 14].
В зависимости от потребностей организмов они выполняют различные функции, такие как защита от патогенов и пищевая цель. В частности, многочисленные исследования показали, что у ракообразных хитиназы играют важную роль в физиологических процессах, таких как линька, переваривание хитина в пище и иммунная защита [15, 16]. Некоторые данные говорят о том, что хитиназы могут участвовать в осморегуляции при изменении солености воды или реагировать на это изменение [17].
В настоящее время основное внимание уделяется хитинолитическим, хитозанолитическим, деацетилирующим и другим хитинмодифицирующим ферментам, синтезируемым микробиологически. Описаны различные микроорганизмы (бактерии, грибы), производящие ферменты различной субстратной специфичности и различного действия на хитин/хитозан.
Микроорганизмы вырабатывают хитиназу для переваривания хитинового питательного вещества или для частичного гидролиза хитиновой клеточной стенки для пролиферации клеток.
Хитин является основным компонентом клеточной стенки грибов. Грибные хитиназы, как и бактериальные хитиназы, имеют множество функций, поскольку играют важную роль в питании, морфогенезе и процессах развития грибов.
У высших растений хитиназы используются для защиты от растительных патогенов и вредителей [18]. Хитиназы морских водорослей также играют роль в защите, аналогичную хитиназам растений [19]. У насекомых и ракообразных хитиназа действует путем деградации экзоскелетного хитина в кутикуле или панцире в процессе линьки.
Хитиназы являются важнейшими ферментами для ракообразных. Хитиназа играет важную роль в физиологических процессах у ракообразных, таких как линька, переваривание хитина в пище и иммунная защита [16].
Синтез и превращения хитиновых структур, осуществляемые несколькими хитин-синтезирующими и хитинолитическими ферментами, необходимы для роста и развития членистоногих. В предлиночный период эпидермис выделяет хитиназы, которые разрушают внутренние слои старого экзоскелета, одновременно синтезируя новый экзоскелет [20]. Пищеварительный тракт выделяет хитиназы, которые разрушают поступающий с пищей хитин и защищают от вирусных патогенов [21]. Хитиназа (1,4-β-поли-N-ацетилглюкозаминидаза, EC 3.2.1.14) – это эндогликозидаза, которая расщепляет внутренние связи в полимерах хитина, образуя олигомерные фрагменты и хитобиозу. Они, в свою очередь, гидролизуются до N-ацетил-β-глюкозамина N-ацетил-β-глюкозаминидазой и хитобиозидазой [20].
Хитинолитические ферменты играют важную роль в защите ракообразных от патогенных грибов [14]. Хитиназа также была обнаружена у млекопитающих и рыб. Таким образом, эти живые организмы производят и используют хитиназу для своих специфических и биологических целей. Также приводятся сведения о существовании различных хитинолитических ферментов в тканях и органах морских организмов – рыб, беспозвоночных. Обсуждается вопрос источника хитинолитических ферментов у рыб и беспозвоночных, а именно, являются ли эти ферменты эндогенными, или они синтезируются присутствующими во внутренних органах животных различными микроорганизмами. Более тщательные исследования подтвердили эндогенный путь образования этих ферментов [22].
Ракообразные представляют потенциально возможный источник хитинолитических, хитозанолитических и других ферментов, модифицирующих хитин, для промышленного производства. Это обусловлено большими объемами отходов переработки ракообразных.
3. Биотрансформация хитина
Основные цели биотрансформации хитина – это получение водорастворимых производных (хитозана, олигомеров, мономеров): хитозана, низкомолекулярных хитина и хитозана, олигосахаридов хитина (ацетилированных хитоолигосахаридов), хитоолигосахаридов (олигосахаридов хитозана), N-ацетилглюкозамина и солей D(+)-глюкозамина.
Основным сырьем для получения хитиновых продуктов в настоящее время считаются отходы промышленной переработки ракообразных, которые содержат большие количества хитина и требуют утилизации.
Переработка хитинсодержащих отходов осуществляется преимущественно химическими способами. Хитин извлекают щелочной депротеинизацией и кислотной деминерализацией. Хитин перерабатывают с получением хитозана щелочным деацетилированием хитина и D(+)-глюкозамина гидролизом в концентрированных кислотах.
Последние годы все больше внимания уделяется возможности замены химических способов ферментативными или биотехнологическими.
Промышленное производство хитинолитических ферментов пока находится в стадии становления. Предпочтение отдается микробиологической технологии получения хитинолитических ферментов. Например, в подробных публикациях российских ученых [23, 24] оценивается возможность промышленного микробиологического производства хитинолитических ферментов.
Несмотря на значительный прогресс в области биотехнологической переработки хитина, достигнутый за последние десятилетия, химические подходы преобладают над ферментативными на промышленном уровне. Зеленые технологии сдерживаются чрезмерной стоимостью производства высококачественных ферментов и более низким выходом по сравнению с химическими способами переработки [25]. Высокая степень кристалличности нативного хитина в водном растворе представляет собой дополнительную проблему, требующую более устойчивой стратегии предварительной обработки в долгосрочной перспективе.
Ферментативные способы, представленные в различных научных публикациях, до настоящего времени не получили достаточного обобщения в отличие от химических способов. Хитиназы рассматриваются подробно, но редко делается акцент на практической стороне вопроса – как применять хитиназы для переработки хитина и какие продукты могут быть получены?
Производство хитинолитических ферментов из отходов ракообразных или рыб пока отсутствует, хотя идея потенциального выделения хитинолитических ферментов из внутренних органов этих гидробионтов и их практическое применение для получения ХОС присутствует в публикациях некоторых ученых [26, 27].
Благодаря интересным данным о биологической активности олигомеров хитина и хитозана, хитинолитические ферменты привлекли к себе большое внимание, а хитиназа рыб и ракообразных может быть использована для производства целого ряда хитиновых продуктов для здоровья. Кроме того, из-за несовместимых физико-химических свойств хитиновых продуктов, полученных кислотным или щелочным гидролизом, постоянно востребованы дешевые хитинолитические ферменты с улучшенной каталитической способностью. В этой связи отходы морского рыболовства являются потенциальным источником для извлечения хитиназ с высокой каталитической способностью.
4. Получение олигосахаридов хитина и хитозана
Химический подход модификации хитина породил ряд проблем, связанных с загрязнением окружающей среды. В отличие от них, ферментативный подход способен восполнить этот недостаток. Поэтому биодеградация, особенно ферментативный гидролиз, имеет большое значение для переработки хитиновых отходов с целью получения низкомолекулярных продуктов, в первую очередь олигосахаридов [28, 29]. Хотя многие хитиназы уже изучены, поиск экологически безопасных ресурсов и стратегий для получения олигосахаридов хитина и хитозана остается сложной задачей [5].
По сравнению с химическими и физическими методами, ферментативный метод является экологически чистым, а процесс легко контролируется. Кроме того, олигомеры могут быть получены без каких-либо дополнительных модификаций.
Однако стоимость ферментов все еще относительно высока, а отсутствие фундаментального понимания каталитических механизмов ферментов препятствует получению хитоолигосахаридов и их мономеров с помощью ферментативного подхода.
В первую очередь изучается действие специфических ферментов – хитиназ, хитозаназ.
В последнее время было изучено и охарактеризовано множество хитиназ из различных видов, включая животных, растения, насекомых, грибы и бактерии. Морские бактерии являются прекрасными источниками для производства хитиназ. В частности, бактерии, которые постоянно выживают при низких температурах, в основном выделяют холодоадаптированные ферменты, что важно в низкотемпературной каталитической реакции. Специфические ферменты могут превращать хитин в биологически активные соединения, такие как хитоолигосахариды и N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc), которые могут найти применение в медицине и биотехнологии. Ферменты, участвующие в естественном производстве хитоолигосахаридов, можно разделить на два типа: ферменты, осуществляющие специфический ферментативный гидролиз (хитиназа, хитозаназа, глюканаза и т.д.), и ферменты, осуществляющие неспецифический ферментативный гидролиз (лизоцим, протеаза, липаза, амилаза, целлюлаза и т.д.). По сравнению с кислотным гидролизом, ферментативное разложение, очевидно, проще в эксплуатации и контроле. Что еще более важно, ферментативная деградация может генерировать продукты без дополнительных модификаций. Однако стоимость, доступность и специфичность ферментов ограничивают их применение и коммерческое использование.
Несколько типов неспецифических протеолитических и полисахаридных гидролаз были использованы для получения хитозановых олигомеров. К ним относятся папаин, пепсин и проназа, различные типы целлюлозы, лизоцим. Например, в образец хитозана добавляли смесь пектиназы из Phizopus oryzae, папаина из латекса папайи. Реакция деполимеризации протекает при 39 °C в течение 24 ч. Оказалось, что при этом образуется олигомер хитозана с содержанием олигомеров (димеров-октамеров) 33 %, а димеров-тетрамеров – 54 % [30].
5. Получение N-ацетилглюкозамина и D(+)-глюкозамина
Мономером хитина является глюкозамин (GlcN), который также обладает множеством биоактивных свойств, включая функции в органогенезе растений и эмбриогенезе беспозвоночных. Глюкозамин и его ацетилированное производное (N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)), которые могут быть получены из хитина/хитозана, широко применяются в пищевой, экономической, косметической и фармацевтической промышленности, особенно при лечении артрита [10]. Соответственно, в промышленности востребованы высокоэффективные процессы получения глюкозамина. Безусловно, хитин является подходящим биосырьем для производства глюкозамина благодаря его обильному воспроизводству в природе.
Превращение хитина в N-ацетилглюкозамин осуществляется при избирательном расщеплении гликозидных связей, а получение глюкозамина включает либо деацетилирование и гидролиз хитина, либо деполимеризацию хитина и деацетилирование образующегося N-ацетилглюкозамина. Ферментативный гидролиз является экологически чистым методом получения мономеров хитина и хитозана. Ферменты, участвующие в хитинолитической системе, представлены следующим образом: эндохитиназы (EC 3.2.1.1.4), экзохитиназы (EC 3.2.1.14), хитобиазы (EC 3.2.1.30) и β-N-ацетил-гексозаминидазы (EC 3.2.1.52). Эти ферменты работают совместно, превращая хитин в N-ацетил-D-глюкозамин. Эндохитиназы гидролизуют хитин до олигомеров, таких как хитотетраозы и хитотриозы. Причем N-ацетил-хитобиозы преобладают в конечных продуктах гидролиза хитина эндохитиназами. В отличие от них, экзохитиназы высвобождают N-ацетил-хитобиозу без образования GlcNAc или олигомеров. β-N-ацетил-гексозаминидазы могут расщеплять N-ацетил-хитобиозу, N-ацетил-хитотриозу и N-ацетил-хитотетраозу до мономеров GlcNAc.
Экзо-β-D-глюкозаминидаза (экзохитозан, EC 3.2.1.165) расщепляет хитозан или олигомеры хитозана, последовательно высвобождая D-глюкозамин из нередуцирующего терминала. Таким образом, гидролиз на основе экзо-β-D-глюкозаминидазы является потенциальным методом получения D-глюкозамина. Экзо-β-D-глюкозаминидаза демонстрирует более высокую скорость расщепления хитотетраозы и хитопентаозы. Она может расщеплять GlcN-GlcNAc, но не GlcNAc-GlcNAc.
Ферментативный гидролиз для получения глюкозамина является перспективным подходом. Однако этот подход сложнее, чем химический гидролиз, поскольку необходимо учитывать как производство ферментов, так и производство глюкозамина. Кроме того, ферментативные процессы все еще нуждаются в тщательной оптимизации для решения вопросов, связанных с низким выходом и неполным превращением хитина в мономеры.
6. Отходы переработки ракообразных и способы их утилизации
Продукция рыболовства и аквакультуры не полностью используется для потребления человеком. Фактически переработка рыбы, моллюсков и других морских животных приводит к образованию значительного количества отходов, которые, в зависимости от вида, могут достигать 50–70 % от общего объема производства [31].
Отходы рыболовства и аквакультуры обычно выбрасываются в море или на свалки, в лучшем случае перерабатываются в рыбную муку и рыбий жир [14].
В рыбной промышленности и аквакультуре растет потребность в переходе на безотходный подход за счет полной утилизации продукции рыболовства и аквакультуры, сокращения образования отходов и повышения ценности производимых отходов. Переработка отходов рыболовства и аквакультуры не только снижает их серьезное воздействие на окружающую среду, но и повышает их экономическую ценность [31, 32].
В рамках концепции «голубой биоэкономики», в которой устойчивое использование океана и его ресурсов является приоритетом, крайне важно минимизировать и/или исключить образование отходов [33]. Благодаря обилию ценных биомолекул (ферментов, белков/пептидов, полиненасыщенных жирных кислот, каротиноидов, минералов и гидроксиапатита, а также полисахаридов, включая хитин и гликозаминогликаны) отходы переработки морских гидробионтов представляют ценное сырье [34, 35].
Ферменты из отходов переработки морских гидробионтов представляют интерес с нескольких точек зрения. Во-первых, наличие уникальных свойств, высокой активности, разнообразной субстратной специфичности. Во-вторых, было обнаружено, что ферменты морского происхождения обладают свойствами холодовой адаптации (то есть активны в диапазоне от 0 до 30 °C, но нестабильны при температуре выше 50 °C [36]. В-третьих, получение ценных ферментов – элемент комплексной переработки отходов, получение продуктов с добавленной стоимостью.
Уникальные возможности представляют отходы переработки ракообразных. После получения пищевой продукции – мышечной ткани конечностей крабов или креветок остается до 60 % отходов, включающих несъедобный хитиновый покров и внутренности. Многочисленные исследования показывают, что эти отходы являются сырьем для получения различных углеводов (полисахаридов – хитина, хитозана, их производных, моносахаридов – глюкозамина и ацетилглюкозамина, липидов и каротиноидов, активных белков – ферментов, обладающих широким спектром различной субстратной активности – протеолитической, коллагенолитической, хитино- и хитозанолитической и др. В конечном счете неутилизируемый белок панцирьсодержащих отходов и внутренностей может послужить сырьем для получения ферментативных белковых гидролизатов различного назначения. Минеральная часть панциря ракообразных, представляющая комплекс карбонатов и фосфатов кальция, магния и других металлов, оказывается хорошим минеральным премиксом в корма сельскохозяйственной птицы и животных.
Заключение
Таким образом, анализ сведений по использованию ферментов для биотрансформации хитина показал, что эта проблема очень актуальна и решаема. В настоящее время основное внимание уделяется использованию микробиологических источников ферментов и получению рекомбинантных ферментов с заданными свойствами. Тем не менее вопрос выделения ферментов, существующих в отходах промысла и переработки рыбы и беспозвоночных, остается также важным. С нашей точки зрения, выделение хитинолитических ферментов в рамках комплексной безотходной технологии переработки промысловых крабов может быть целесообразным. Идеи, высказываемые в проанализированных публикациях, позволят разработать научный подход к подготовке хитина для ферментолиза, а также развить методы аналитического определения, экстракции и очистки ферментов из тканей ракообразных. В перспективе рассматривается возможность использования ферментных систем морских микроорганизмов, проявляющих хитинолитическое действие.