Научный журнал
Научное обозрение. Биологические науки
ISSN 2500-3399
ПИ №ФС77-57454

ВЫДЕЛЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ВЕЩЕСТВАМ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Исрапилова А.И. 1 Адиева А.А. 1, 2 Искакова А.А. 2
1 ФГБУН Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра Российской академии наук
2 ГАОУ ДО РД «Центр развития талантов «Альтаир»
Аннотация. В контексте взаимоотношений человека и животных кишечная палочка (E. coli) выступает как в качестве комменсала кишечника, так и в качестве одного из наиболее важных патогенов человека и животных, способного вызывать кишечные и внекишечные инфекции. Устойчивость E. coli к антибиотикам неуклонно растет с момента первых зарегистрированных случаев, и из-за ее воздействия на здоровье человека она теперь включена вместе с остальными представителями семейства Enterobacteriaceae в список Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) из 12 семейств бактерий, представляющих наибольшую угрозу для здоровья человека. В данной работе использованы вещества природного происхождения, обладающие противобактериальным действием. Показано наличие у соединений данного класса антибактериальных свойств в отношении изолятов, выделенных со смывов рук учащихся. Для сравнительного анализа были изучены коммерческие антибиотики, рекомендованные в лечении инфекций, вызванных данными бактериями. В результате микроскопического исследования на грязных руках учащихся было выявлено наличие кишечной палочки, стафилококка не обнаружено. Наиболее чувствительным в отношении кишечной палочки со средним значения ингибирования роста оказался цефтриаксон. Воздействие природных антибиотиков (лук, чеснок, лимон) на микрофлору грязных рук показало, что самым эффективным из них является чеснок.
антибактериальное действие
вещества
диско-диффузионный метод
1. Vávrová S., Struhárnanská E., Turna J., Stuchlík S. Tellurium: A Rare Element with Influence on Prokaryotic and Eukaryotic Biological Systems // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22. № 5924. DOI: 10.3390/ ijms22115924.
2. Abudawood M., Alnuaim L., Tabassum H., Ghneim H.K., Alfhili M.A., Alanazi S.T., Alenzi N.D., Alsobaie S. An Insight into the Impact of Serum Tellurium, Thallium, Osmium and Antimony on the Antioxidant/Redox Status of PCOS Patients: A Comprehensive Study // Int J Mol Sci. 2023. Vol. 24 (3). P. 2596. DOI: 10.3390/ijms24032596.
3. Bamunusinghage N.P.D., Neelawala R.G., Magedara H.P., Ekanayaka N.W., Kalupahana R.S., Silva-Fletcher A., Kottawatta S.A. Antimicrobial Resistance Patterns of Fecal Е.coli in Wildlife, Urban Wildlife, and Livestock in the Eastern Region of Sri Lanka, and Differences between Carnivores, Omnivores, and Herbivores // J Wildl Dis. 2022. Vol. 58, Is. 2. P. 380–383.
4. Galindo-Méndez M. Antimicrobial Resistance in Е. coli // E. Coli Infections – Importance of Early Diagnosis and Efficient Treatment // IntechOpen. Sep. 30. 2020. DOI: 10.5772/intechopen.93115.
5. Jeje O., Ewunkem A.J., Jeffers-Francis L.K., Graves J.L. Jr., Serving Two Masters: Effect of Е.coli Dual Resistance on Antibiotic Susceptibility // Antibiotics (Basel). 2023. Vol. 13, Is. 3. P. 2–8.
6. Nuzhdina A.V., Morozov A.S., Kopitsyna M.N., Strukova E.N., Shlykova D.S., Bessonov I.V., Lobakova E.S. Simple and versatile method for creation of non-leaching antimicrobial surfaces based on cross-linked alkylated polyethyleneimine derivatives // Materials Science and Engineering. C. 2017. Vol. 70. P. 788–795. DOI: 10.1016/j.msec.2016.09.033.
7. Адиева А.А., Климова Р.Р., Абакаров Г.М., Меджидова М.Г., Джамалова С.А., Омарова Д.К., Меджидов М.А. Изучение биологических свойств теллурсодержащих гетероциклических соединений // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2021. № 10. С. 7–11.

Широкое распространение кишечной палочки в человеческой популяции и рост штаммов с устойчивостью к антибиотикам обусловливает поиск новых веществ синтетического происхождения, обладающих антибактериальным действием. Но вместе с тем в природе существует большое количество разнообразных естественных антибиотиков. Их содержат многие лекарственные растения: чеснок, лук, имбирь и т.д. В отличие от синтетических антибиотиков, они не подавляют иммунитет. Поэтому поиск новых соединений, обладающих антибактериальным действием, и сравнение их с природными аналогами остается актуальной проблемой в современном мире.

Исследование терапевтической активности соединений теллура довольно ограничено в литературе, несмотря на относительное обилие теллура в организме человека. Сходство селена и теллура охватывает не только их отношение к позиции в периодической таблице химических элементов, но, в значительной степени, их химию и биохимию. Ранее исследования теллурсодержащих соединений рассматривались только с точки зрения их токсических свойств. Однако получены новые интригующие данные, свидетельствующие о том, что соединения теллура имеют очень богатый потенциал использования в медицине, как в свое время селен, рассматривающийся только как ядовитое вещество, оказался важнейшим компонентом антиоксидантной защиты [1]. Были изучены биологические эффекты теллура и некоторых его неорганических и органических производных, и данные исследования привели к интересным и многообещающим результатам. В качестве примера можно выделить использование теллуритов и теллуратов щелочных металлов в микробиологии, антиоксидантное действие органотеллуридов и диорганодителлуридов и иммуномодулирующее действие нетоксичного неорганического теллурана [2].

При поступлении соединений теллура в клетку нарушается трансмембранный протонный градиент у E. coli независимо от уровня резистентности. Этот эффект сопровождается ингибированием синтеза АТФ, что приводит к истощению внутриклеточных запасов АТФ во время аэробного роста [1]. Такое же повреждающее действие соединений теллура обнаружено при синтезе белков, содержащих аминокислоты с восстановленными тиоловыми группами [1, 2] как у низко-, так и у высокорезистентных микробов.

Е. coli – одна из наиболее изученных бактерий в мире. У людей E. coli является наиболее частой причиной инфекций мочевыводящих путей, она была идентифицирована как возбудитель заболевания практически во всех анатомических участках человеческого тела [3]. Кишечная палочка (Е. coli) является нормальным обитателем человеческого организма, находясь в кишечнике и выполняя важные функции. Однако некоторые штаммы кишечной палочки могут вызывать серьезные заболевания, особенно у подростков. Подростковый организм чувствителен и уязвим к воздействию вредных бактерий, таких как кишечная палочка. Это может быть связано с неправильным питанием, недостатком гигиены или сопряженными заболеваниями. Многие подростки предпочитают быструю и удобную пищу, содержащую высокий уровень жиров, соли и сахара. Это может нарушить нормальное функционирование кишечной флоры и способствовать росту патогенных бактерий, включая кишечную палочку. Симптомы инфекции кишечной палочкой у подростков разнообразны и могут включать боли в животе, понос, рвоту, лихорадку и общую слабость. Если не обратить внимание на эти симптомы и не начать лечение, инфекция может развиться в более серьезные и опасные заболевания, такие как гастрит, воспалительные процессы, а в некоторых случаях и сепсис. Однако важно отметить, что большинство случаев инфекции кишечной палочкой у подростков могут быть предотвращены с помощью соблюдения основных правил гигиены и здорового питания. Правильное мытье рук перед едой, употребление свежих и натуральных продуктов, надлежащая обработка и приготовление пищи – все это может существенно снизить риск заражения кишечной палочкой [4]. В связи с широким распространением бактерии в человеческой популяции используют тесты на определение чувствительности. Полученные данные антибиотикограммы анализируются с учетом известных стандартов и рекомендаций по лечению инфекций, вызванных кишечной палочкой. Учитывая, что некоторые штаммы этих бактерий могут развивать устойчивость к антибиотикам, постоянный мониторинг чувствительности является крайне важным для эффективного лечения. Благодаря проведению антибиотикограммы можно выбрать оптимальное лечение, учитывая индивидуальную чувствительность пациента и способность антибиотиков подавлять рост кишечной палочки. Это позволяет достичь максимальной эффективности терапии и предотвратить возникновение повторных инфекций [5].

Целью настоящей работы было культивирование образцов E. coli, выделенных от подростков, и определение чувствительности данного микроорганизма к синтетическим веществам, обладающим антибактериальным действием, а также веществам природного происхождения.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести биологический эксперимент по выращиванию колоний бактерий E. сoli из определенных участков подросткового организма и выявлению воздействия природных антибиотиков на них.

2. Исследовать природные антибиотики (лук, лимон и чеснок) и определить их влияние на микроорганизмы.

3. Провести анализ чувствительности данной флоры к коммерческим антибиотикам, используя диско-диффузионный метод.

4. Исследовать действие производных теллура на рост бактериальной культуры.

Материалы и методы исследования

Посевы на флору

Посев биоматериала проводили с целью выделения и идентификации экологически значимых микроорганизмов с определением чувствительности выделенных патогенов к обычному спектру антимикробных препаратов. Основной целью микроскопического исследования мазка являлось обнаружение бактерий, а также оценка качества полученного материала. Микроскопическое исследование мазка проводили с помощью светового микроскопа после окрашивания по методу Грама.

Подготовка дисков с синтезированными теллурорганическими соединениями для проведения диско-диффузионного метода

Вначале было определено количество жидкости, которое впитывает диск. Для этого взвешивали сухие диски, затем выдерживали 5 мин в 1 мл воды и проводили повторное взвешивание. Сухой диск весил 0,0018 г, влажный диск – 0,0161 г. Разница составляла 0,0143 г, то есть диск впитывал 0,0143 мл воды за 5 мин. Далее рассчитали навеску на этот объем, чтобы на диске было, например, 135 мкг/мл для вещества 1. Для этого 0,0472 г вещества разводили в 5 мл фосфатного буфера и получали исходную концентрацию вещества 1. Вещества были разведены в пяти концентрациях с учетом их цитотоксичности. В качестве контроля использовали коммерческие диски и традиционную постановку метода дисков и определения чувствительности флоры к ним [6].

Результаты исследования и их обсуждение

Выявление микроорганизмов в подростковой среде и определение чувствительности их к антибиотикам

Для обнаружения уникальных образцов собственных патогенных микроорганизмов со смывов грязных рук и определения чувствительности их к мылу, антисептику и антибиотикам были взяты смывы с грязных рук 34 детей возрастной категории от 14 до 16 лет, участников профильной смены «Альтаир». В течение учебного дня детей просили не мыть и не протирать руки влажными салфетками, смывы брали в конце учебного дня. Для обнаружения кишечной палочки (Е. coli) и стафилококка (Staphylococcus aureus) использовали стандартные питательные среды. Результаты представлены в табл. 1.

В результате посевов, взятых с необработанных рук учащихся, была выявлена кишечная палочка, стафилококк не обнаружен. При исследовании смывов с рук после обработки рук патогенные микроорганизмы не обнаружены.

Таблица 1

Результаты лабораторного исследования на кишечную палочку (Е. coli) и стафилококк (Staphylococcus aureus)

Исследуемый материал

Кишечная палочка

Стафилоккок

Пробирка № 1, смыв с грязных рук

Огромное количество, более 50 колоний

Нет роста

Пробирка № 2, смыв с чистых рук после мытья с мылом

Небольшое количество, 5–7 колоний

Нет роста

Пробирка № 3, смыв с чистых рук после обработки антисептиком

Нет роста

Нет роста

Пробирка № 4, смыв с пищеблока

(разделочная доска)

Небольшое количество, 13–15 колоний

Нет роста

Пробирка № 5, контроль

Нет роста

Нет роста

Таблица 2

Определение чувствительности бактерий к производным теллура с использованием метода дисковой диффузии

Теллурорганические соединения (ТОС)

E. coli

Вещество 1 Диоксисироцикло-[4-метилфенил] теллурохлорид

14,27 (0,12)

Вещество 2 3-Хлорметилдиоксисинроциклофенилтеллур хлорид

13,83 (0,15)

Вещество 3 Этилтеллуробензаль-[2-метокси-3,5-дихлор] анилин

12,6 (0,41)

Примечание: приведены средние значения для трех повторов, в скобках указаны значения стандартного отклонения, показывающие, насколько разбросаны значения в выборке относительно среднего значения.

Диско-диффузный метод определения чувствительности к антибиотикам культуры Е. coli показал, что в результате действия антибиотиков наибольшую биологическую активность проявил цефтриаксон, со средним значением 19,79 мм. На втором месте по эффективности оказался цефотаксим, со средним значением зоны ингибирования 18,74 мм. Менее эффективным из коммерческих препаратов оказался цефазолин. Зона ингибирования роста культуры кишечной палочки составила 12,73 мм.

Результаты по определению чувствительности бактерий к ТОС диско-диффузионным методом представлены в табл. 2.

В таблице приведены данные при бактериальной нагрузке 1,5х108. Зона подавления роста микроорганизмов варьирует от 12 до 14,5 мм. Сравнительный анализ показал, что эти значения находятся на уровне чувствительности к коммерческим дискам, содержащим различные антибиотики, но высокая токсичность производных теллура и растворимость только в ДМСО уменьшает их привлекательность в качестве потенциальных антибактериальных средств.

Влияние фитонцидов лука репчатого (Alliym cepa), чеснока (Alliym sativum) и лимона (Citrus limon) на рост и развитие колоний микроорганизмов

Для определения воздействия лука, лимона и чеснока на рост колоний бактерий были исследованы посевы смывов с грязных рук. Для этого смывы с рук наносили на питательную среду в чашки Петри. В центр чашек поместили мелко нарезанные лук, чеснок и лимон. Через 2–3 дня оценили результат опыта. Результаты опыта показали, что колонии микроорганизмов появились во всех пробах, кроме пробы с чесноком (рис. 1). В чашке с лимоном микробы появились только по краям, а в чашке с луком – по всей поверхности. По всей видимости, чеснок является самым мощным противомикробным средством.

Биологические свойства гетероциклических производных теллура и их зависимость от присоединенной группировки были описаны ранее [7], данные соединения отличаются тем, что введены новые группировки. Все теллурорганические вещества прошли проверку биологических свойств на системе PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances). В данной серии опытов также были изучены все три гетероциклических соединения:

1) диоксисироцикло-[4-метилфенил]теллурохлорид (вещество 1);

2) 3-хлорметилдиоксисинроциклофенилтеллур хлорид (вещество 2);

3) этилтеллуробензаль-[2-метокси-3,5-дихлор] анилин (вещество 3).

Вещества были разведены в пяти концентрациях с учетом их цитотоксичности. Цитотоксичность для данных соединений была определена в предварительных опытах на перевиваемой линии клеток зеленой мартышки (Vero) на 1 (ОЦД50) и 3 (ЦД50) сутки после обработки монослоя клеток различными концентрациями исследуемых веществ. Исходя из проведенных расчетов, для эксперимента были подготовлены диски, на которые были нанесены следующие концентрации исследуемых веществ:

Вещество 1 – диоксисироцикло-[4-метилфенил] теллурохлорид (ОЦД50 = 13,5 мкг; в 10 больше, 135 мкг; в 2 больше, 27 мкг; в 2 меньше, 6,75 мкг; в 10 меньше, 1,35 мкг).

Вещество 2 – 3-хлорметилдиоксисинроциклофенилтеллур хлорид (ОЦД50 = 1,2 мкг; в 10 больше, 12 мкг; в 2 больше, 2,4 мкг; в 2 меньше, 0,6 мкг; в 10 меньше, 0,12 мкг).

Вещество 3 – этилтеллуробензаль-[2- метокси-3,5-дихлор] анилин (ОЦД50 = 2 мкг; в 10 больше, 20 мкг; в 2 больше, 4 мкг; в 2 меньше, 1 мкг; в 10 меньше, 0,2 мкг).

missing image file

Рис. 1. Сравнительный анализ активности производных теллура на культуру кишечной палочки

Действие веществ изучалось при различной бактериальной нагрузке, но видимый эффект был выявлен только при бактериальной нагрузке 1,5х108 КОЕ/мл, что приблизительно соответствует 0,5 по стандарту Макфарланда и меньше. На рис. 2 показана степень подавления образования колоний Е. coli при концентрации 1,5х108 КОЕ/мл в чашке Петри через 24 ч производными теллура, в присутствии коммерческих антибиотиков и при обработке ДМСО.

missing image file

Рис. 2. Чувствительность Е. coli к производным теллура при концентрации 1,5х108 КОЕ/мл

Из изученных трех соединений первое вещество подавляло количество колоний на 80 %, а второе – на 40 %. При этом надо отметить, что размеры колоний также были относительно маленькими по сравнению с колониями в контрольной чашке. Вещество 3 – этилтеллуробензаль-[2-метокси-3,5-дихлор] анилин антибактериального эффекта в отношении данного микроба не имело.

Заключение

В ходе исследования изолированная культура Е. coli была изучена при воздействии веществ, обладающих потенциальным антибактериальным эффектом, и показана различная чувствительность культуры к данным веществам. Вероятно, это связано с различиями в строении присоединенных радикалов. Изучение антибактериального эффекта веществ 2 и 3 (3-хлорметилдиоксисинроциклофенилтеллур хлорида и этилтеллуробензаль-[2-метокси-3,5-дихлор] анилина) не выявило эффективности этих соединений в отношении культур бактерий Е. coli. Воздействие природных антибиотиков (лук, чеснок, лимон) на микрофлору грязных рук показало, что самым эффективным из них является чеснок.


Библиографическая ссылка

Исрапилова А.И., Адиева А.А., Искакова А.А. ВЫДЕЛЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ВЕЩЕСТВАМ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ // Научное обозрение. Биологические науки. – 2024. – № 1. – С. 31-35;
URL: https://science-biology.ru/ru/article/view?id=1350 (дата обращения: 28.05.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674