Scientific journal

Scientific Review. Biological science

ISSN 2500-3399

ПИ №ФС77-57454

Членистоногие по количеству видов и распространённости могут считаться самой процветающей группой живых организмов, они обитают практически повсеместно и способны жить в экстремальных условиях. Протеиназы этих организмов являются необычными ферментами, заметно отличающимися по энзиматическим характеристикам от своих аналогов позвоночных и, особенно, млекопитающих. Многие ферменты членистоногих обладают уникальными свойствами и находят практическое применение в различных отраслях промышленности и медицине. Однако в настоящее время наиболее изучены психрофильные и психротолерантные ферменты из микроорганизмов [3,4].

Камчатский краб относится к отряду Decapoda, подотряду Anomura, семейству Lithodidae, подсемейству Uthodinae, роду Paralithodes. Этот краб – наиболее крупный из четырех промысловых видов северо-западной части Тихого океана. Обитание камчатского краба на родине приурочено к определенным водным массам – крабы совершают вертикальные миграции. По температурному режиму воды шельфа Берингова и Охотского морей в верхней части склона делятся на 3 слоя. Это поверхностный слой со значительными сезонными колебаниями – от высоких значений летом до отрицательных зимой, слой остаточного зимнего охлаждения с постоянно отрицательными значениями (-1,2°С) и промежуточный слой с постоянно низкой, но положительной температурой (около +1,5°С) У ракообразных (крабов, раков и креветок) гепатопанкреас является органом, совмещающим функции печени и поджелудочной железы. Из-за особенностей питания отряда Decapoda гепатопанкреас секретирует большое количество пищеварительных ферментов, гидролизующих все классы природных полимеров и обладающих широкой специфичностью и необычно высокой активностью. Ранее в нашей лаборатории было выделено и изучено несколько коллагеназ P. camtschaticus [5-7]. Цель этого исследования – изучение нового психротрофного катепсина from P. camtschaticus, определение его первичной структуры и энзиматических свойств. Цистеиновые лизосомальные катепсины, принадлежащие к С1 клану, по МЕROPS классификации, играют важную роль в метаболизме белка в клетке [8]. Катепсины декапод мало изучены [9], хотя они представляют несомненный интерес для фундаментальной энзимологии и прикладных исследований.

Выделение и очистка протеиназ камчатского краба

Трудности получения гомогенных эндопептидаз крабов связаны с тем, что в их гепатопанкреасе обнаруживается множество ферментов, лишь незначительно отличающихся молекулярной массой, изоэлектрической точкой, обладающих смешанной субстратной специфичностью. Ранее в нашей лаборатории был получен суммарный препарат протеиназ гепатопанкреаса камчатского краба «Морикраза», который применяется в составе мази для лечения ожогов, гнойно-трофических язв и послеоперационных рубцов.

В растворе Морикразы была обнаружена катепсиновая активность – гидролиз хромогенного субстрата Z-Ala-Phe-Arg-pNА [10] и частичное ингибирование этой активности при преинкубации препарата с раствором HgCl2. Активность по хромогенному субстрату усиливалась в присутствии цистеина и сохранялась при pH=5. Это дало основание полагать, что в Морикразе присутствует цистеиновая протеиназа катепсин. Для выделения фермента на первом этапе была проведена анионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl в градиенте NaCl. После проведения ионообменной хроматографии, фракции, обладающие активностью по ZD-Ala-Phe-Arg-pNА и ингибирующиеся Hg2+, были собраны, сконцентрированы методом ультрафильтрации и нанесены на сефадексе G-50 fine. Пик, обладающий искомой активностью, был сконцентрирован методом ультрафильтрации и исследован методом SDS-электрофореза в ПААГ.

В итоге была достигнута степень очистки в 582 раза. Выход по активности составил 8,23%, однако результат может быть заниженным, так как многие протеиназы, содержащиеся в исходном материале, активны по субстрату ZD-Ala-Phe-Arg-pNА (в особенности мажорная сериновая протеиназа РС1 и трипсин).

Для того чтобы удостовериться в гомогенности полученной катепсиновой фракции, на SDS-электрофорез было нанесено избыточное количество белка (рис. 1). Видно, что присутствующая примесь незначительна, возможно это остаток неактивированного профермента.

Рис. 1. Аминокислотная последовательность катепсина L из гепатопанкреаса of Red King Crab (P. camtschaticus)

Далее был получен и секвенирован полноразмерный ген катепсина L камчатского краба. Нуклеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную последовательность профермента (рис. 2).

Рис. 2. SDS-PAGE катепсина L PC. Электрофорез образцов в 12% полиакриламидном геле, где: (1) полоса фракции очищенного фермента соответствуетo 28 kDa (катепсин L). Полоса, соответствующая 32 kDa, принадлежит проэнзиму. (2) стандарты (85-21 kDa, Fermentas SM-0441)

Анализ кДНК гена и транслированной аминокислотной последовательности показал, что профермент содержит 324 аминокислотных остатка, рассчитанная молекулярная масса 35,4 кДа; pI = 4,88.

Известно, что катепсины L как прокариот, так и эукариот, содержат высококонсервативную лидерную последовательность (16-18 аминокислотных остатков), за которой следует про-последовательность (60-100 аминокислотных остатков).

Лидерная последовательность состоит преимущественно из гидрофобных аминокислотных остатков, что облегчает транспорт катепсина по секреторному пути. Про-последовательность необходима для корректного фолдинга белка, временного нгибирования протеазной активности и транспорта неактивного профермента в эндосомы. В данном случае, аминокислотная последовательность начинается с метионина, который впоследствии отщепляется. Лидерная последовательность выражена слабо, скорее всего, она представлена 19 аминокислотными остатками и заканчивается на Thr19.Это наиболее вариабельный участок последовательности.

На основе сравнения с известными катепсинами других членистоногих было предположено место расщепления про-последовательности для получения зрелого фермента (обозначено красной стрелкой). Обычно, при созревании катепсина L у членистоногих, расщепление происходит вблизи участка высокой консервативности DWR. Более того, в участке P2` преимущественно находится Pro, реже – другая гидрофобная аминокислота (например, Ala). Зрелая форма исследуемого катепсина камчатского краба содержит предположительно 220 аминокислотных остатков, рассчитанная молекулярная масса составляет 23,78 кДа. Согласно SDS-электрофорезу в ПААГ молекулярная масса катепсина составляет 29 кДа, однако, следует учитывать, что на электрофорезе значения масс обычно бывают завышенными. Низкая изоэлектрическая точка, pI=4,82, является характерной чертой большинства ферментов членистоногих.

Для выявления особенностей в первичной структуре исследуемого катепсина, было выполнено сравнение его аминокислотной последовательности с аминокислотными последовательностями катепсинов других членистоногих (Рис. 3).

Рис. 3. MALDI-MS анализ

Рис. 4. Сравнение первичной структуры катепсинов L f из различных Decapoda. Высококонсервативный район отмечен красным, аминокислотные остатки, которые образуют активный центр - желтым, Cys образующий дисульфидные связи – in голубым. Сайт расщепления про-энзима указан стрелкой. 00 – катепсин L из Red King Crab (Paralithodes camtchatica); 01 – катепсин L из cathepsin L from Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei); 02 – катепсин L из cathepsin L from Giant Tiger Prawn (Penaeus monodon); 03 – катепсин L из катепсин L из cathepsin L from Norway lobster (Nephrops norvegicus); 04 – катепсин L из – катепсин L из cathepsin L from African mosquito (Сulex aegypti); 05 – катепсин L из cathepsin L from dermestid beetle (Dermestes frischii)

Рис. 5. Модель третичной структуры катепсина L РС. Розовым отмечены α-спирали, синим – β-слои, белым – петли. Активный центр в красном квадрате

Из приведенных данных видно, что исследуемый катепсин проявляет высокую степень сходства аминокислотной последовательности с катепсинами L других членистоногих (95-97% сходства). В целом, N-конец более вариабельный, C-конец более консервативный. Интересно, что С-концевые 5 аминокислотных остатка SYPLV присутствуют у подавляющего большинства представителей цистеиновых катепсинов членистоногих. Исследуемая аминокислотная последовательность содержит консервативный мотив GCNGG, характерный для большинства цистеиновых протеиназ. В нашем случае, Asn заменен на Gly. Это, вероятно, связано с психротрофностью фермента и увеличивает его лабильность. Катепсин L камчатского краба содержит мотив ERFNIN (EX3RX2(V/I)FX2NX3IX3N), характерный для всех представителей подсемейства катепсинов L. Однако Phe заменен на Tyr. Каталитический Cys окружен участком высокой консервативности. Шесть высококонсервативных остатков Cys, формирующих дисульфидные связи в папаине в позициях 22-65, 56-98, 157-207, присутствуют и в исследуемом катепсине. Общее низкое содержание Arg (4% от всех аминокислот) и отсутствие явных гидрофобных кластеров свидетельствует об адаптации катепсина L камчатского краба к работе при низких температурах (психротрофность). Третичная структура (рис. 5) представляет собой две цепи – тяжелая и легкая, связанные дисульфидными и водородными связями. Между цепями находится активный центр фермента и субстрат-связывающий участок. N-концевой домен образован 3 α-спиралями, С-концевой домен образован 1 α-спиралью и 4 β-листами. Такая организация вторичной структуры является типичной для цистеиновых катепсинов. Относительно большое количество петельных структур на поверхности белковой глобулы является характерной особенностью строения психротрофных ферментов. β-листы находятся, в основном, внутри глобулы и в районе субстрат-связывающего участка. На рис. 6 розовым цветом обозначены α-спиральные участки, синим – β-листы, белым – петли. Красным прямоугольником выделен активный центр фермента (аминокислотные остатки Gln22, Cys28, His167, Asn187). N-концевой домен образован тремя a-спиралями, С-концевой домен образован 1 a-спиралью и 4 β-листами. Такая организация вторичной структуры является типичной для цистеиновых катепсинов. Относительно большое количество петельных структур на поверхности белковой глобулы является характерной особенностью строения психротрофных ферментов. β-листы находятся, в основном, внутри глобулы и в районе субстрат-связывающего участка.

Методом MALDI-MS было показано 100% соответствие первичной структуры выделенного катепсина, определенной по кДНК.

Рис.6. MALDI-MS анализы

Цветом обозначены идентичные участки сравниваемых последовательностей. Гидролиз трипсином (90.9% идентичности): Гидролиз глутпмилэндопептидазой (81.4% идентичности):

Так как катепсины, в основном, являются лизосомальными ферментами, то обычно они активны при кислых рН. Так, для катепсина L из жука-кожееда рН оптимум составляет 4,5; для катепсина L из тихоокеанской белой креветки - 5; большинство катепсинов L млекопитающих обладают наибольшей активностью при pH = 5,5.

Рис. 6. Температурный оптимум. Активность фермента измерена по субстрату Z-Ala-Phe-Arg-pNA. 1 – катепсин L из краба P.camtschaticus; 2 – катепсин L из жука Dermestes frisii

Однако исследуемый катепсин камчатского краба показал наибольшую ферментативную активность по хромогенному субстрату ZD-Ala-Phe-Arg-pNА при слабощелочных условиях, с оптимумом рН = 8,0. При этом, катепсин L камчатского краба также сохраняет активность при кислых рН. Исходя из этих данных, можно предположить, что исследуемый катепсин является секретируемым белком, а не лизосомальным. Температурный оптимум катепсина камчатского краба находится при 25 ºC (рис.6). Однако, было обнаружено, что фермент способен гидролизовать хромогенный субстрат при температуре ниже 20 °С, и даже при 0 ºC. Это позволяет отнести исследуемый фермент к психротрофным. При повышении температуры до 50-60 ºC происходит резкое падение активности. Если провести 30-минутную пре-инкубацию фермента при 60 ºC и только потом добавить субстрат, то активность падает до 0. Это говорит о тепловой денатурации катепсина при данной температуре. Также в ходе работы было замечено, что исследуемый катепсин быстро теряет свою каталитическую активность при температуре выше 35 °С (падение удельной активности ~ на 25% за 4 часа нахождения при температуре 37 ºC).

Таблица 1

Выделение катепсина камчатского краба

Сравнение с катепсином L, жука выделенным из Dermestes frischii Т оптимум которого находится при 37°С, показало, что температурах меньше 10°С фермент жука не активен, при 42°С, в отличие от катепсина краба, сохраняет 24% активности.

Субстратная специфичность

Из таблицы 2 видно, что исследуемый катепсин обладает амидазной активностью и эффективно гидролизует синтетические хромогенные субстраты. С наибольшей эффективностью расщепляется синтетический субстрат ZD-Ala-Phe-Arg-pNА. № 2-6 являются стандартными субстратами для сериновых и трипсиноподобных протеиназ, как видно, некоторые из них (№ 2, 3) исследуемый катепсин хорошо гидролизует, другие (№ 4, 6) практически не гидролизует. Arg в положении Р1 является важным фактором гидролиза субстрата данным ферментом При сравнении активности катепсина по субстратам № 2 и 3, видно, что замена Arg на Lys в положении P1 уменьшает уровень гидролиза на 27%. Субстат трипсина (BZ-Arg-pNА) исследуемым катепсином практически не гидролизуется, несмотря на наличие Arg в положении Р1. № 13, 14 являются классическими субстратами папаина и бромелаина. Для исследуемого катепсина, по всей видимости, эти субстраты являются слишком короткими для эффективного связывания, поэтому их гидролиз идет на низком уровне. Нахождение Leu вместо Ala в положении Р1 в субстрате № 14 сильно снижает степень гидролиза. Также практически не гидролизуются субстраты эластаз (№ 18) и пролиновых эндопептидаз (№ 19).

Таблица 2

Действие катепсина L PC на синтетические субстраты. Все исследования были проведены при pH=8,0, 25 °C, в присутствии 5mM Cys

Для изучения особенностей гидролиза пептидных связей был проведен гидролиз полученным катепсином физиологически активных пептидов известного строения – мелиттина, А и В цепей инсулина. Рис 7а.

Стрелками обозначены места гидролиза пептидов исследуемым катепсином. Красными стрелкам выделены места, наиболее предпочтительные для гидролиза.

Из приведенных данных видно, что исследуемый катепсин обладает широкой субстратной специфичностью. В положении Р1 предпочитает полярные, положительно заряженные аминокислотные остатки, особенно Arg. Чуть менее интенсивно идет гидролиз, если Arg в Р1 заменить на Lys. Однако, если в положении P1 находится His, то гидролиз не идет. Также, для активного гидролиза субстратов исследуемым катепсином важно, чтобы в положении Р2 находились гидрофобные аминокислотные остатки, что характерно для цистеиновых протеиназ. Предпочтительно, чтобы положение Р2 занимали Leu, Val, Ile Phe. Менее интенсивно катепсин расщепляет пептиды когда в положении P2 находится Trp или Аla. Удивительно, что в отличие от своих аналогов у других организмов (например, катепсины L из жука-кожееда и тихоокеанской белой креветки) исследуемый катепсин может гидролизовать субстраты с Asp в положении Р2. В нативных пептидных субстратах возможен гидролиз после полярных незаряженных аминокислотных остатков в положении Р1: Thr, Tyr, Ser. Также было установлено, что данный фермент не гидролизует небольшие пептиды. Это, скорее всего, связано с особенностями строения субстрат-связывающей впадины: из-за отсутствия “запирающей петли” исследуемый катепсин не проявляет экзопептидазную активность. Продолговатая форма субстрат-связывающей впадины, образованной, в основном, незаряженными аминокислотными остатками не способствует эффективному связыванию небольших пептидов.

Общая коллагенетическая активность исследуемого катепсина была проверена постепени гидролиза азоколлагена. Удельная активность по азоколлагену составляет 3,25 М/мин/мг белка. Далее был проведен гидролиз коллагена в течение 2 и 4 часов при комнатной температуре. Результаты приведены на SDS электрофорезе в ПААГ (рис. 7). Из приведенных данных видно, что исследуемый катепсин обладает коллагенолитической активностью. Коллаген X типа гидролизуется несколько быстрее, чем коллаген VI типа. В обоих случаях первые признаки гидролиза заметны уже через 2 часа инкубации фермента с коллагеном, причем в первую очередь расщеплению подвергаются β-цепи. После 4 часов инкубации катепсина с коллагеном VI типа a и β цепи полностью гидролизованы и коротких пептидов на электрофореграмме не видно. В случае коллагена X типа, за 4 часа происходит полный гидролиз всех трех видов цепей.

Таблица 3

Гидролиз синтетических хромогенных субстратов.